非諾貝特對(duì)LPC誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增生和凋亡的影響及機(jī)制探討.pdf

1、研究背景: 血管內(nèi)皮細(xì)胞為襯覆于血管內(nèi)腔面的單層扁平細(xì)胞，依靠其正常的增殖和凋亡平衡，保證血管的結(jié)構(gòu)和功能正常。近年研究表明，越來(lái)越多的心血管疾病的發(fā)生發(fā)展與內(nèi)皮細(xì)胞增殖及凋亡失衡有關(guān)。動(dòng)脈粥樣硬化性疾病是危害人類健康的一大類疾病，內(nèi)皮細(xì)胞損傷是動(dòng)脈粥樣硬化(AS)形成的始動(dòng)環(huán)節(jié)。研究顯示：氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)作用于內(nèi)皮細(xì)胞膜，引起一系列過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)并產(chǎn)生大量的脂質(zhì)過(guò)氧化物。這些脂質(zhì)過(guò)氧化物不僅直接損傷細(xì)胞的DN

2、A，還誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。ox-LDL是內(nèi)皮細(xì)胞損傷的關(guān)鍵因素之一，而溶血卵磷脂(LPC)是OX-LDL的主要活性成分，因此，本課題以培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察LPC對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響及非諾貝特的干預(yù)作用。 血管內(nèi)皮細(xì)胞不僅是血液和組織之間的屏障，還是一個(gè)十分活躍的代謝及內(nèi)分泌器官，合成并分泌多種活性物質(zhì)，在機(jī)體自身防病中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。一氧化氮(NO)是內(nèi)皮細(xì)胞合成的一個(gè)重要舒血管活性物質(zhì)，能保持血管依賴性舒

3、張活動(dòng)，調(diào)節(jié)組織血流灌注，預(yù)防血管痙攣，抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，防止內(nèi)膜異常增生等。而內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)是內(nèi)皮細(xì)胞合成NO的關(guān)鍵酶，因此eNOS是研究NO合成和作用的一個(gè)主要環(huán)節(jié)。 細(xì)胞凋亡(apoptosis)是基因調(diào)控下的細(xì)胞自我消亡過(guò)程。細(xì)胞凋亡對(duì)心血管系統(tǒng)的許多疾病具有重要意義，但現(xiàn)在對(duì)于調(diào)控細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制仍不十分清楚。凋亡抑制蛋白家族(IAPs)在抑制細(xì)胞凋亡過(guò)程中起重要作用。研究顯示：腫瘤及某些腦血管

4、疾病中IAPs均發(fā)生明顯變化。x連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)是lAPs的主要成員，但尚罕見其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及凋亡影響的研究報(bào)道。非諾貝特是臨床上廣泛應(yīng)用的調(diào)脂藥。文獻(xiàn)報(bào)道非諾貝特可抑制血小板粘附聚集、改善內(nèi)皮依賴性血管舒張功能、預(yù)防和延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程、降低心血管急性事件的發(fā)病率，但其機(jī)制尚不十分明確。本研究擬初步探討非諾貝特對(duì)內(nèi)皮保護(hù)的作用機(jī)制。 第一章LPC對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生及凋亡的影響及非諾貝特的干預(yù)作用 目

5、的：觀測(cè)LPC對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生及凋亡的影響及非諾貝特對(duì)其的干預(yù)作用。 方法：取體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)，在含不同濃度LPC(5mg／L、10 mg／L、20 mg／L)的培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)6h、12h、24h、48h，用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法、流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡觀測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞增殖及凋亡的變化，并探索LPC誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖及凋亡的最佳濃度。然后用不同濃度的非諾貝特(10μmol／L、50μmol／L、1

6、00μmol／L)預(yù)處理HUVECs 8h后和LPC共同孵育24h，觀測(cè)非諾貝特對(duì)LPC誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增生和凋亡的影響。 結(jié)論：LPC抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。10mg／L LPC孵育24 h是LPC誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生和凋亡的最佳濃度和時(shí)間。非諾貝特可干預(yù)LPC對(duì)HUVECs增生及凋亡的影響，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。 第二章 非諾貝特對(duì)LPC誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞eNOS及XIAP基因表達(dá)的影響

7、 目的：探討非諾貝特對(duì)LPC誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞NO生成、eNOS及XIAP基因表達(dá)的影響。 方法：體外培養(yǎng)HUVECs分為①正常對(duì)照組、②LPC組(LPC 10mg／L)、③低濃度非諾貝特組(非諾貝特10 μmol／L+LPC 10 mg／L)、④中濃度非諾貝特組(非諾貝特50 μmol／L+LPC 10mg／L)及⑤高濃度非諾貝特組(非諾貝特100、μmol／L+LPC10 mg／L)。用不同濃度的非諾貝特(10μmo

8、l／L、50μmol／L、100 μmol／L)預(yù)處HUVECs 8 h后和LPC(LPC 10 mg／L)共同孵育24 h，觀測(cè)非諾貝特對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞N0生成、eNOS及XIAP基因表達(dá)的影響。采用硝酸還原酶法測(cè)定NO含量，分別用實(shí)時(shí)定量PCR、免疫組化、westernblot及流式細(xì)胞儀檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞eNOS及XIAP mRNA及蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)論： (1)LPC抑制HUVECs eNOS mRNA及蛋白表達(dá)，N

9、O合成減少。非諾貝特可改善LPC對(duì)HUVECs的影響，使內(nèi)皮細(xì)胞eNOSmRNA及蛋白表達(dá)升高，NO生成增加，從而起到抗動(dòng)脈硬化作用。 (2)LPC抑制XIAP mRNA及蛋白表達(dá)。非諾貝特可通過(guò)上調(diào)XIAP基因表達(dá)調(diào)控LPC對(duì)HUVECs增生及凋亡的影響。 第三章 非諾貝特對(duì)冠心病患者血管內(nèi)皮依賴性舒張功能及血清NO濃度的影響 目的：探討冠心病患者血管內(nèi)皮功能及血清NO濃度的變化及非諾貝特的干預(yù)作用。