胰腺癌中microRNA-216a表達(dá)下調(diào)靶向調(diào)節(jié)JAK2抑制細(xì)胞增殖.pdf

1、研究背景：
　　胰腺癌是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，在我國(guó)胰腺癌的發(fā)病率逐年上升，目前已躍居全身腫瘤第6位?？傮w上講，胰腺癌病因復(fù)雜，發(fā)生發(fā)展中具有異質(zhì)性。胰腺導(dǎo)管腺癌是最常見(jiàn)的胰腺癌類(lèi)型，根治性手術(shù)對(duì)于可切除性腫瘤患者仍是唯一可以獲得長(zhǎng)期生存的治療方法。然而，胰腺癌早期診斷困難，易侵襲，對(duì)各種治療缺乏敏感性，預(yù)后較差，死亡率幾乎等同于發(fā)病率。過(guò)去的25年間，胰腺癌總體預(yù)后并無(wú)明顯改善，5年生存率小于5％，中位生存時(shí)間約5～6個(gè)月

2、。胰腺癌的發(fā)病形勢(shì)日益嚴(yán)峻,病死率一直居高不下,目前對(duì)胰腺癌的生物學(xué)標(biāo)志進(jìn)行了大量而廣泛的研究,包括基因標(biāo)記、血清學(xué)標(biāo)記和細(xì)胞學(xué)標(biāo)記等,由于這些指標(biāo)的特異性和敏感性各有差異,利用這些免疫標(biāo)志物進(jìn)行診斷仍有很多缺陷,需要有對(duì)胰腺癌的診治有臨床意義更好的指標(biāo)。目前胰腺癌的基因診治是研究熱點(diǎn)之一。microRNAs(miRNAs)是由20-25個(gè)核苷酸所組成的小分子單鏈RNA，可通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合靶基因的3’非編碼區(qū)（UTR），影響mRNA

3、翻譯和蛋白合成。miRNAs屬基因負(fù)調(diào)控因子?？稍谵D(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，從而影響細(xì)胞的發(fā)育、分化和凋亡等，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌組織、細(xì)胞株、癌前病變、和血漿中均存在miRNAs表達(dá)譜異常，提示miRNAs可能在胰腺癌發(fā)生和發(fā)展機(jī)制的研究、診斷、治療和預(yù)后判斷中具有一定應(yīng)用價(jià)值。
　　研究目的
　　本研究旨在檢測(cè)miR-216a在胰腺癌組織與非胰腺癌組織中的表達(dá)，篩選并驗(yàn)證miR-216a與細(xì)胞增殖有關(guān)的靶基因JAK2

4、，合理聯(lián)系miR-216a與JAK/STAT通路。
　　研究方法
　　1.20例胰腺癌組織與非胰腺癌組織中總RNA的提取。采用agilent人microRNA寡核苷酸基因芯片在基因組范圍內(nèi)檢測(cè)組織標(biāo)本的microRNA基因表達(dá)譜，差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)是microRNA相對(duì)表達(dá)量大于或等于對(duì)照組2倍。
　　2.應(yīng)用TargetScanHuman5.1、microrna.org、mirbaseandPicTaralgorit

5、hms預(yù)測(cè)并篩選miR-216a與細(xì)胞增殖有關(guān)的靶基因。
　　3.JAK23’UTR與mutJAK23’UTR測(cè)序，預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)，擴(kuò)增，PCR釣取基因，目段片段（JAK23’UTR或mutJAK23’UTR）與載體（PsiCHECK-2）連接，miR-216amimics與miR-216ainhibitor（miR-216a反義鏈）合成。NC（negativecontrol；隨機(jī)合成的一條堿基鏈）及NCinhibitor（NC的反

6、義鏈）的合成。
　　4.PANC-1細(xì)胞培養(yǎng)，microRNA與質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，Lucifersae檢測(cè)。
　　5.miR-216amimics與miR-216ainhibitor轉(zhuǎn)染PANC-1細(xì)胞，WesternBlot檢測(cè)JAK2蛋白表達(dá)。
　　6.采用SPSS13.0軟件分析，miR-216a的表達(dá)量以log2轉(zhuǎn)換樣本歸一化(normalization)后的芯片掃描信號(hào)值為記。胰腺癌組與良性病變組miR-216

7、a的表達(dá)差異采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，計(jì)量資料均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，以雙側(cè)檢驗(yàn)P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果
　　1.20例胰腺標(biāo)本的RNA濃度測(cè)定:所有樣品A260/A280在1.8～2.0之間,RNA純度較高,無(wú)DNA、蛋白質(zhì)等污染。
　　2.miR-216a的表達(dá)量測(cè)定:miR-216a在胰腺癌組織中的表達(dá)明顯低于非胰腺癌組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。
　　3.JAK2的3’U

8、TR大小為1392bp，用模板DNA擴(kuò)增后在MarkerDL2000的1kb上方可見(jiàn)有一條比較特異條帶。PsiCHECK-2約7kb，目的片段與質(zhì)粒連接后質(zhì)粒酶切鑒定陽(yáng)性克隆，在1kb左右（基因片段）與6kb左右（載體片段）分別切出一條相應(yīng)帶。并且，連接后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI公布的JAK23’UTR、mutJAK23’UTR序列進(jìn)行Blast分析，提示目的片段已成功克隆入雙螢光報(bào)告載體psiCHECK-2中，可以用于后續(xù)雙螢光檢測(cè)；

9、
　　4.JAK2是miR-216a與細(xì)胞增殖的靶基因之一。在轉(zhuǎn)染克隆有JAK23’UTR質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)中，mir-216a組與空白組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），mir-216a組與NC組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），證明miR-216a能與JAK23’UTR結(jié)合，從而抑制螢光素酶的活性。在轉(zhuǎn)染克隆有mutJAK2-4基因3’UTR質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)中，mir-216a組與空白組和NC組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.

10、280；P=0.329），證明miR-216a不能與mutJAK23’UTR結(jié)合，從而抑制螢光素酶的活性。在轉(zhuǎn)染Psi-CHECK2質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)中，mir-216a組與空白組和NC組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.848；P=0.258），證明Psi-CHECK2上沒(méi)有miR-216a的結(jié)合位點(diǎn)，miR-216a具有靶向性結(jié)合。
　　5.胰腺癌細(xì)胞系PANC-1細(xì)胞培養(yǎng)，生長(zhǎng)良好，形態(tài)正常，無(wú)污染。PANC-1細(xì)胞中JAK2蛋白表達(dá)量

11、升高。轉(zhuǎn)染72小時(shí)后miR-216amimics組與miR-216ainhibitor組中JAK2蛋白表達(dá)顯著差異（miR-216ainhibitor組JAK2蛋白相對(duì)灰度值分別為空白對(duì)照組及mimics組的1.333倍和68.038倍）。JAK2蛋白表達(dá)量與miR-216a水平呈負(fù)相關(guān)。
　　研究結(jié)論
　　1.miR-216a在胰腺癌組織與非胰腺癌組織的表達(dá)具有顯著差異，miR-216a在胰腺癌組織中表達(dá)顯著下調(diào)。