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文檔簡介
1、5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶EPSPS(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase,EPSPS:EC2.5.1.19)是莽草酸途徑中的關(guān)鍵酶,能夠催化PEP(磷酸烯醇式丙酮酸)與SP3(莽草酸-3-磷酸)生成EPSP(5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸),為芳香族氨基酸的合成提供前體物質(zhì),該酶廣泛地存在于微生物及高等植物體內(nèi)。由于EPSPS是除草劑草甘膦的靶標酶,所以篩選高抗草甘膦EPSP
2、S新基因的研究工作被廣泛展開,來自根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium sp.)CP4菌株的EPSPS對高濃度的草甘膦表現(xiàn)出非常高的抗性,此后該基因被廣泛地應(yīng)用于多種作物的轉(zhuǎn)基因研究中,截止2010年,包括大豆、玉米、油菜、棉花、甜菜和苜蓿等,播種面積近8930萬公頃的轉(zhuǎn)基因作物中都含有該抗除草劑基因。面對大量含有CP4-EPSPS轉(zhuǎn)基因的作物或食品進口我國,建立科學(xué)的檢測方法尤為迫切。雖然現(xiàn)在市場上有多種用于轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)測定的試劑盒
3、,但不同廠商采用不同的工藝表達以及方法確定參考物質(zhì)的量值,無法溯源到上一級的計量標準,造成測定結(jié)果不準確和缺乏可比性,由此給生物安全監(jiān)管帶來隱患,并產(chǎn)生一系列法律、貿(mào)易等經(jīng)濟和社會問題。
為獲得穩(wěn)定來源并且具有高純度的CP4-EPSPS蛋白,本研究首先構(gòu)建了CP4-EPSPS的細菌表達載體,并首次實現(xiàn)此基因在大腸桿菌BL21(transtta)菌種中的表達。超聲波破碎菌體后,發(fā)現(xiàn)該重組蛋白并未以包涵體形式存在于細胞質(zhì)中,而
4、是以可溶的形式存在于細胞破碎上清液中,為下游的蛋白純化工作帶來極大的便利,通過二步鎳柱親和層析后,CP4-EPSPS重組蛋白的純度可達99.9%以上,符合作為標準物質(zhì)的要求。
為驗證所提純的CP4-EPSPS蛋白做為標準物質(zhì)的可行性,本文構(gòu)建了CP4-EPSPS植物表達載體,通過組培的方法,獲得了49株檢測為陽性的煙草苗。經(jīng)過Elisa驗證16株煙草有明顯的表達。以提純的CP4-EPSPS蛋白做為標準物質(zhì),稀釋成不同的濃度
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