PI3K-Akt信號(hào)介導(dǎo)缺血預(yù)適應(yīng)在心肌梗死豬中抗心律失常及心功能修復(fù)作用.pdf

1、研究背景及目的：
　　急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction，AMI)已成為心血管疾病中死亡率不斷增加的重要原因。心肌梗死后的惡性心律失常及心力衰竭是心肌梗死病人死亡的常見(jiàn)原因。心肌缺血預(yù)適應(yīng)(Ischemic preconditioning，IP)是心肌在經(jīng)過(guò)反復(fù)短暫的缺血再灌注后能預(yù)防或減弱隨后長(zhǎng)期有害的缺血再灌注損傷。研究表明缺血預(yù)適應(yīng)可以抑制心室重構(gòu)，減低心律失常的發(fā)生，減小心肌梗死面積，但至

2、今機(jī)理尚未完全明確。有報(bào)道IP的心肌梗死后心肌保護(hù)作用與相關(guān)的血管生長(zhǎng)因子的表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Basic Fibroblast Growth Factor，bFGF），缺血預(yù)適應(yīng)的保護(hù)作用也取決于縫隙連接蛋白43(connexin43，Cx43)通道的形成，縫隙連接蛋白43缺乏降低了心肌對(duì)缺血再灌注損傷的耐受力，減弱

3、了心肌梗死后缺血預(yù)適應(yīng)減小心梗面積的保護(hù)作用。然而，連接蛋白43介導(dǎo)的保護(hù)作用與缺血預(yù)適應(yīng)誘導(dǎo)的抗炎、抗心律失常作用與血管生成之間的確切潛在內(nèi)在關(guān)系還有待建立。既往有研究表明，缺血預(yù)適應(yīng)可以觸發(fā)機(jī)體的保護(hù)機(jī)制，如使腺苷、緩激肽、內(nèi)皮素等增加，通過(guò)相應(yīng)受體激活“再灌注損傷補(bǔ)救激酶途徑”(Reperfusion Injury Salvage Kinase，RISK)通路，包括磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidyl-ino

4、sitol-3-kinase/protein kinaseB，PI3K/Akt)通路，導(dǎo)致效應(yīng)器的基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)增加，從而發(fā)揮抗缺血再灌注損傷的作用。我們的前期實(shí)驗(yàn)表明缺氧微環(huán)境后促進(jìn)血管新生，側(cè)枝循環(huán)形成這些作用與PI3K/Akt通路有關(guān)。盡管PI3K途徑在缺血預(yù)適應(yīng)中心臟保護(hù)作用至關(guān)重要，但PI3K/Akt信號(hào)通路在梗死心肌經(jīng)過(guò)缺血預(yù)處理之后的抗心律失常作用的機(jī)理尚不十分清楚。
　　我們對(duì)磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K/Akt）

5、在缺血預(yù)適應(yīng)中對(duì)連接蛋白43和促血管生成因子的影響進(jìn)行探討研究，特別是缺血預(yù)適應(yīng)保護(hù)缺血誘導(dǎo)的心律失常，改善心臟功能及抑制心肌重塑的作用。在此，我們研究了不同的缺血模型的心臟保護(hù)作用與室性心律失常的發(fā)生及對(duì)心臟性猝死的影響，通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路來(lái)確定是否連接蛋白43和血管生成因子參與這些影響因素，從而探討缺血預(yù)適應(yīng)在抗惡性室性心律失常及改善心功能方面的可能機(jī)制，為心肌梗死后心律失常及心力衰竭的預(yù)防與治療提供新的思路。

6、　　研究方法：
　　實(shí)驗(yàn)分組方法:在誘導(dǎo)心肌梗死(MI)模型前將研究中使用的90只實(shí)驗(yàn)小豬，隨機(jī)選擇10只正常實(shí)驗(yàn)小豬進(jìn)行開(kāi)胸手術(shù)和假結(jié)扎LAD冠狀動(dòng)脈，成為對(duì)照組。其他的80只實(shí)驗(yàn)小豬被隨機(jī)分為接受局部肌肉注射磷酸鹽緩沖鹽水組(PBS)或局部注射PI3K抑制劑LY294002組，其中的20只實(shí)驗(yàn)小豬被隨機(jī)分配到接受IP或沒(méi)有IP組。即將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為五組:CON(對(duì)照)組(N=10)，LI（前降支結(jié)扎）組(N=20)，IPLI

7、（缺血預(yù)適應(yīng)+前降支結(jié)扎）組(N=20)，LYLI（注射LY294002+前降支結(jié)扎）組(N=20)，LYIPLI（注射LY294002+缺血預(yù)適應(yīng)+前降支結(jié)扎）組(N=20)。
　　研究方法:在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將實(shí)驗(yàn)小豬行超聲心動(dòng)圖檢查，測(cè)LVEF、LVFS、LVEDIVST、LVEDPW、LVEDV、LVESV、LVEDD和LVESD值，在誘導(dǎo)心肌梗死(MI)模型前，將研究中使用的90只實(shí)驗(yàn)小豬，隨機(jī)選擇10只正常實(shí)驗(yàn)小豬進(jìn)行開(kāi)胸

8、手術(shù)和假結(jié)扎LAD冠狀動(dòng)脈，成為對(duì)照組。其他的80只實(shí)驗(yàn)小豬被隨機(jī)分為接受局部肌肉注射磷酸鹽緩沖鹽水組(PBS)或局部注射PI3K抑制劑LY294002組，其中的20只實(shí)驗(yàn)小豬被隨機(jī)分配到接受IP或沒(méi)有IP組。接下來(lái)，所有的動(dòng)物進(jìn)行左前降支結(jié)扎冠狀動(dòng)脈(LAD)誘導(dǎo)心肌梗死模型，術(shù)中及術(shù)后記錄小豬發(fā)生心律失常情況，包括LAD結(jié)扎誘發(fā)首次惡性室性心律失常的時(shí)間間隔和12小時(shí)內(nèi)惡性室性心律失常累計(jì)發(fā)作時(shí)間和次數(shù)。術(shù)后60分鐘，予行心電圖(E

9、CG)，超聲心動(dòng)圖(UCG)，冠狀動(dòng)脈造影(CAG)證實(shí)血管閉塞。并隨訪7天，經(jīng)心超檢查測(cè)得LVEF、LVFS、LVEDIVST、LVEDPW、LVEDV、LVESV、LVEDD和LVESD值，通過(guò)TIMI評(píng)分判定各組側(cè)枝循環(huán)情況。然后處死小豬，取出心肌。通過(guò)H&E染色法(H&E staining)，氯化三苯基四唑染色法(TTC染色)和馬森三色染色法(Masson's trichrome stain)，探討IP對(duì)心肌梗死后心肌組織重構(gòu)，

10、心肌炎癥，梗死面積大小和膠原蛋白含量的影響。通過(guò)實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)各組心肌梗死后7天Akt和縫隙連接蛋白43的mRNA水平。通過(guò)免疫印跡電泳顯示各組Akt蛋白水平，磷酸化Akt Ser473表達(dá)水平，磷酸化Akt Thr308表達(dá)水平和連接蛋白43的水平，計(jì)算磷酸化Akt Thr308和磷酸化AktSer473與總Akt的各自比值。通過(guò)免疫組化觀察在梗死區(qū)局部表達(dá)Akt和縫隙連接蛋白43的情況。通過(guò)實(shí)時(shí)定量RT-PCR，定量分析A

11、ng-1、bFGF和VEGF的mRNA表達(dá)水平。蛋白免疫印跡檢測(cè)各組結(jié)扎LAD后7天左心室梗死周圍區(qū)域內(nèi)的Ang-1、bFGF和VEGF蛋白的表達(dá)水平。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色顯示心肌梗死后7天各組VEGF、Ang-1、bFGF局部表達(dá)情況，應(yīng)用血管因子VIII抗體染色分析心梗后各組梗死周邊血管密度。
　　研究結(jié)果：
　　1.在心肌梗死后7天，缺血預(yù)適應(yīng)可以顯著降低動(dòng)物死亡率和惡性室性心律失常的發(fā)生。延長(zhǎng)心梗后首次惡性室性心律失

12、常發(fā)作間隔，縮短惡性室性心律失常累計(jì)發(fā)作時(shí)間。應(yīng)用PI3K抑制劑LY294002則取消這些作用。
　　2.IP明顯提高心梗后LVEF和LVFS，改善左室重構(gòu)指標(biāo)(LVEF、LVFS、LVEDIVST、LVEDPW、LVEDV、LVESV、LVEDD和LVESD)。使用PI3K抑制劑LY294002則明顯降低LVEF、LVFS值，加重左室重構(gòu)。
　　3.缺血預(yù)適應(yīng)可以明顯改善梗死心肌組織重構(gòu)，表現(xiàn)為減少心肌的炎癥反應(yīng)和減小心肌

13、梗死面積，減少膠原面積，增加梗死區(qū)域殘存心肌存活數(shù)量。使用PI3K抑制劑LY294002則使梗死心肌重構(gòu)惡化，表現(xiàn)為增加炎癥反應(yīng)，膠原含量及心梗面積，減少梗死區(qū)域心肌存活。
　　4.IP促進(jìn)心梗后Akt表達(dá)水平增高，促進(jìn)Akt磷酸化，上調(diào)心肌組織縫隙連接蛋白43表達(dá)，改善心肌重構(gòu)，應(yīng)用PI3K抑制劑LY294002明顯抑制Akt表達(dá)，降低Akt磷酸化及縫隙連接蛋白43表達(dá)。
　　5.IP促進(jìn)梗死心肌血管生長(zhǎng)因子Ang-1、b