無患子乙醇提取物抗非酒精性脂肪肝的實驗研究.pdf

1、研究背景
　　 肝臟是機體新陳代謝的重要器官，脂肪性肝?。‵atty liver disease）是指脂肪(主要是甘油三酯TG)在肝臟過度沉積的臨床病理綜合癥，其病理表現(xiàn)為單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纖維化和肝硬化。肝有門靜脈和肝動脈雙重血供，但兩者最終都是通過終末微靜脈和微動脈與肝血竇相連，完成與肝細胞的物質(zhì)交換后匯集于肝靜脈，因此肝竇是完成肝臟物質(zhì)交換的主要場所。而肝竇內(nèi)皮細胞(Liver sinusoidal end

2、othelial cell LSEC)與肝枯否(kupffer)細胞是主要的肝竇狀隙細胞，且與肝內(nèi)物質(zhì)代謝及肝臟生理病理變化密切相關(guān)。LSEC受損，窗孔調(diào)節(jié)失控，如持續(xù)或過度擴張可使原不能通過的富含甘油三酯的乳糜微粒(CM)被肝細胞攝取造成脂質(zhì)在肝細胞的堆積，引起急性脂肪肝。
　　 無患子（Sapindus mukorossi Gaertn）為無患子科無患子屬的一種落葉大喬木，其果實又名肥皂樹、洗手果或圓肥皂等，分布于我國長江流

3、域以南地區(qū)及臺灣省，日本、朝鮮、中南半島和印度等地也常栽培。無患子味苦，性寒，有小毒;具有清熱祛痰、消積殺蟲之功效。近年來，隨著對無患子研究的深入，其化學成分及其藥理作用已逐漸被發(fā)現(xiàn)，引起人們越來越多的關(guān)注。
　　 無患子作為中藥材在我國有悠久的使用歷史。據(jù)考證，無患子始載于《本草拾遺》，《植物名實圖考》亦有附圖，關(guān)于其藥用價值早在《本草綱目》中就有記載?，F(xiàn)代藥理基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，無患子具有多種生理活性和藥用價值，主要包括抗腫瘤、降

4、壓、抗菌、抗炎等，有報道表明無患子皂苷對高脂血癥大鼠血脂代謝有一定調(diào)節(jié)作用，但對無患子防治脂肪肝方面的研究尚未見報道。
　　 本研究的預(yù)實驗結(jié)果表明，無患子粗提物對大鼠脂肪肝的形成具有一定的干預(yù)作用。在此基礎(chǔ)上，本課題擬對無患子乙醇提取物的抗非酒精性脂肪肝作用進行深入研究。
　　 本研究擬通過大鼠體內(nèi)實驗檢測血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、

5、低密度脂蛋白(LDL)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）、堿性磷酸酶(ALP)、脂聯(lián)素(APN)含量等指標的變化，以及運用掃描電鏡和透射電鏡技術(shù)觀察正常和脂肪肝動物肝竇狀隙細胞(LSEC)及kupffer細胞形態(tài)、數(shù)量及功能的變化，探討分析肝竇狀隙細胞(LSEC)的變化與相關(guān)酶類和細胞因子表達的改變在脂肪肝發(fā)病過程中的相關(guān)性，并給予中藥無患子進行干預(yù)，進一步探尋脂肪肝的發(fā)病機制及藥物作用靶點，為脂肪肝的防治提供新的思路與方法。
　　

6、 研究目的：
　　 1、對無患子入藥部位——無患子果皮進行性狀和顯微鑒定，認清無患子有效成分的物質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，為下一步篩選該藥活性成分（部位）提供理論依據(jù)。
　　 2、通過急性毒性實驗，測定本課題所使用的無患子乙醇提取物對小鼠的半數(shù)致死量(LD50)，以保證實驗用藥過程的安全性和有效性。
　　 3、通過檢測實驗動物血清中轉(zhuǎn)氨酶、脂蛋白等生化指標，以及觀察實驗動物肝臟細胞、LSEC窗孔、kupffer細胞等與脂肪肝相

7、關(guān)的細胞因子的變化，初步探討這些酶類、細胞因子與肝竇狀隙細胞在脂肪肝發(fā)病過程中的相關(guān)性。
　　 4、采用藥物無患子醇提物進行干預(yù)，驗證其調(diào)節(jié)血脂、保肝護肝的療效，為進一步探尋脂肪肝發(fā)病機制，尋找藥物作用靶點提供參考資料。
　　 實驗方法：
　　 1、制作藥材顯微制片
　　 ①永久制片:無患子干燥果皮，按常規(guī)石蠟切片，番紅-固綠染色，中性樹膠封片。
　　 ②粉末裝片:無患子干燥果皮，65℃烘干1.5

8、h，粉碎后，取粉末制作水裝片和水合氯醛透化裝片。
　　 2、藥物提取液制備
　　 取無患子果皮，干燥粉碎后，第一次先用4倍量85％乙醇浸泡30min，90℃回流提取2h，收集提取液;第二次再用3倍量85％乙醇回流提取1.5h，兩次提取液過濾后合并，濃縮至1g/ml，于4℃保存?zhèn)溆谩?br>　　 3、急性毒性實驗
　　 將KM小鼠60只，隨機分為6組，每組10只，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)，先適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。按小鼠急性毒

9、性實驗常規(guī)方法，給藥前禁食不禁水12h，第1組至第6組分別按照500、1000、2000、3000、4000、5000mg/kg的劑量給藥，每天灌胃2次（0.8mL/只），每次相隔12h，給藥后觀察小鼠是否出現(xiàn)聳毛、蜷臥、耳殼蒼白或充血、突眼、步履蹣跚、肌肉癱瘓、呼吸困難、驚厥、昏迷、大小便失禁等毒性反應(yīng)，連續(xù)給藥觀察14天。
　　 4、脂肪肝動物模型的建立及實驗分組
　　 將體重220±20g的健康SD大鼠飼養(yǎng)在20±

10、3℃自然光照環(huán)境下，取食飲水自由，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)，正常飼養(yǎng)1周后開始造模，每周統(tǒng)一時間稱量體重。實驗分組:將48只實驗SD大鼠隨機分分為正常對照組、模型組、辛伐他汀陽性對照組(7.2 mg/kg)、無患子提取物高、中、低劑量治療組(0.5、0.1、0.05g/kg)。除正常對照組投喂普通飼料，其他組均投喂高脂飼料連續(xù)6周，第4周開始同時對各藥物組大鼠以相應(yīng)藥物進行灌胃（2mL/只），正常對照組和模型組灌胃等體積蒸餾水;第42天17:

11、00后禁食不禁水，第43天8:00處死實驗大鼠采集血液和肝臟標本。
　　 5、血清中生化指標以及肝功能指標的檢測
　　 第43天，把實驗動物用10％水合氯醛(3mL/kg)麻醉后通過腹主動脈取血4～5mL，經(jīng)3000r/min×15min離心，取上層血清，立即將大鼠血清樣本送至南方醫(yī)科大學中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗科檢測AST、ALT、TC、TG、HDL-C、LDL-C、γ-GT、ALP、APN含量，脂聯(lián)素(APN)按試劑盒指示

12、進行操作。
　　 6、病理切片、電鏡樣本的制備與觀察
　　 ①病理切片:取出肝臟后，稱濕質(zhì)量，計算肝指數(shù)，并在肝右葉離邊緣1cm處，橫切一塊肝組織（約3mm×3mm×10mm）用10％中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，HE染色。
　　 ②掃描電鏡:大鼠在體從肝門靜脈插管，經(jīng)0.9％生理鹽水沖洗，灌注液滴注，待血液從下腔靜脈切口流出至肝組織無血色停止灌注，取一塊肝組織（部位、大小同上）浸泡于電鏡用戊二醛中固定，4℃保存，

13、再經(jīng)逐級脫水，CO2臨界點干燥，噴鍍Pt，用掃描電鏡觀察肝組織結(jié)構(gòu)及LSEC上窗孔的數(shù)目和大小。
　　 ③透射電鏡:取出大鼠新鮮肝組織（部位同上、約1 mm3），浸泡于電鏡用戊二醛中固定，4℃保存，經(jīng)逐級脫水，用環(huán)氧樹脂Epon812包埋劑37℃浸透并聚合包埋，修整后逐層切薄片，染色干燥后，用透射電鏡觀察肝細胞結(jié)構(gòu)及其細胞器的數(shù)目和形態(tài)。
　　 7、統(tǒng)計方法
　　 實驗結(jié)果數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分

14、析，半數(shù)致死量(LD50)應(yīng)用SPSS13.0軟件中的Probit模塊（概率單位回歸）求出;計量資料采用One-WayANOVA方差分析，結(jié)果以平均數(shù)±標準差（X±s）表示，以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義;等級資料采用K Independent Samples非參數(shù)檢驗，以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、無患子果皮顯微鑒定
　　 ①外果皮為2～4層細小的類方形表皮細胞，外被較厚角質(zhì)層，內(nèi)含紅棕

15、色物質(zhì)呈柵欄狀排列;中果皮靠近表皮一側(cè)具有6～10層厚角細胞，內(nèi)含棕色物質(zhì)，其內(nèi)側(cè)為薄壁細胞和大量溶生式分泌腔，可見眾多草酸鈣簇晶、方晶、石細胞夾雜其中，外韌型維管束稀疏分布，韌皮部外側(cè)有木化的纖維束;內(nèi)果皮細胞4～5層極扁平的木化細胞，緊密層疊。
　　 ②粉末棕色，極粘稠。外果皮細胞表面觀呈不規(guī)則圓形，含棕色物質(zhì)，直徑20μm～25μm，細胞壁厚;草酸鈣簇晶散在，直徑12μm～35μm;內(nèi)果皮細胞狹長，寬約10μm，以長軸方向

16、在不同細胞層嵌列，可見方晶鑲嵌其中;纖維多為成束的晶鞘纖維，直徑10μm～15μm;可見螺紋導(dǎo)管、石細胞單個散在。
　　 2、急性毒性實驗
　　 在2周給藥時間內(nèi)，第1組小鼠(500mg/kg)表現(xiàn)正常，無死亡記錄;第2組小鼠(1000mg/kg)服藥后，出現(xiàn)輕微脫毛，且活動能力稍有減弱，2周內(nèi)死亡4只;第3組（2000mg/kg）與第4組小鼠(3000mg/kg)服藥后出現(xiàn)不同程度的脫毛，生存小鼠精神萎靡，活動力差，經(jīng)

17、常瞇眼，蜷臥嗜睡，食欲不振，灌胃時躁動不安，分別于第1周死亡4只和5只;第5組小鼠(4000mg/kg)出現(xiàn)較大面積脫毛現(xiàn)象，生存小鼠鼻腔周圍抽搐或出血，呼吸急促，行動不協(xié)調(diào)，且大便量少，呈黑色黏稠狀，第1周內(nèi)死亡6只，尸體鼻腔有血跡;第6組小鼠(5000mg/kg)于3天內(nèi)全部死亡，尸體皮膚發(fā)暗，口腔或鼻腔有血跡，剖開腹部發(fā)現(xiàn)其消化道腫脹，胃腸道內(nèi)充滿氣泡狀液體，其他內(nèi)臟器官顏色發(fā)黑。
　　 3、各組體重和肝指數(shù)
　　

18、 與正常對照組比較，模型組處死前體重顯著降低，肝濕重以及肝指數(shù)顯著升高(P＜0.05或P＜0.01)，說明脂肪肝造模成功;與模型組比較，各個給藥組大鼠的肝濕重和肝指數(shù)均顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，說明藥物對脂肪肝模型有一定防治作用。
　　 4、血脂生化檢測結(jié)果
　　 與正常對照組比較，模型組血清中TC、TG、LDL-C、AST、ALT、γ-GT、ALP均顯著升高(P＜0.01)， HDL-C、APN顯著降低(

19、P＜0.05或P＜0.01);與模型組比較，辛伐他汀組和無患子高劑量組(0.5g/kg)均能降低血清中TC、TG、LDL-C、AST、ALT并升高HDL-C和APN(P＜0.05或P＜0.01)，但對降低γ-GT和ALP，無患子各劑量組之間無統(tǒng)計學意義。
　　 5、光鏡觀察結(jié)果
　　 正常對照組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝索排列整齊，肝細胞大小均勻，多數(shù)肝細胞見一個細胞核，部分可見雙核，肝竇清晰，匯管區(qū)無炎癥細胞浸潤;模型組多數(shù)肝

20、小葉結(jié)構(gòu)輪廓消失，肝細胞形態(tài)不規(guī)則，多數(shù)腫脹，內(nèi)含大空泡狀脂滴把核擠到一側(cè)，甚者相間氣球樣變，肝竇不清晰，部分肝細胞出現(xiàn)點狀或片狀壞死，可見炎癥細胞浸潤;辛伐他汀組部分肝細胞腫脹、少數(shù)含小泡狀脂滴;無患子高劑量組(0.5g/kg)肝細胞大小均勻，形態(tài)正常，少數(shù)肝細胞腫脹或含脂滴，肝竇清晰;無患子中劑量組（0.1g/kg）部分肝細胞腫脹并含脂滴，肝竇變窄;無患子低劑量組(0.05g/kg)部分肝細胞腫脹含脂滴，可見局灶性壞死。
　　

21、 6、掃描電鏡觀察結(jié)果
　　 ①肝組織結(jié)構(gòu)形態(tài)變化:正常對照組肝細胞索呈放射狀整齊排列，肝竇結(jié)構(gòu)清晰，膠原纖維數(shù)量及形態(tài)正常，貯脂細胞結(jié)構(gòu)正常;模型組幾乎所有肝細胞出現(xiàn)腫脹且大部分含脂滴，肝竇結(jié)構(gòu)不明顯，膠原纖維明顯增生，貯脂細胞脂滴增多明顯;辛伐他汀組肝細胞索排列規(guī)則，肝竇結(jié)構(gòu)清晰，偶見含脂滴肝細胞;無患子高劑量組（0.5g/kg）肝細胞輕度腫脹，偶見含小泡脂滴的肝細胞，局部區(qū)域有少數(shù)膠原纖維增生;無患子中劑量組(0.1g/

22、kg)肝細胞可見含脂滴肝細胞，膠原纖維稍有增生;無患子低劑量組(0.05g/kg)明顯可見大部分肝細胞含大小不一的泡狀脂滴，且膠原纖維明顯增生。
　　 ②LSEC窗孔形態(tài)變化:正常對照組LSEC表面有一定數(shù)量的正常形態(tài)的窗孔(Φ0.05μm～0.2μm)以簇狀排列呈篩孔狀均勻分布;模型組LSEC表面的窗孔（Φ0.3μm～1.2μm）相互融合而失去篩孔結(jié)構(gòu)，每個窗孔都顯著擴張而使LSEC胞體趨于破裂欲脫落狀，可見LSEC下方腫脹的

23、肝細胞表面有微絨毛暴露;與正常對照組比較，辛伐他汀組窗孔(Φ0.05μm～0.2μm)數(shù)量、大小、形態(tài)與正常對照組接近;無患子高劑量組(Φ0.1μm～0.5μm)局部窗孔稍微擴張，但大部分形態(tài)仍保持正常;無患子中劑量組(Φ0.1μm～0.8μm)、無患子低劑量組(Φ0.2μm～1μm) LSEC窗孔分布雜亂，部分篩孔狀結(jié)構(gòu)互相連通成大窗孔，LSEC下方肝細胞表面的微絨毛暴露，但仍有小部分局域窗孔保持篩孔狀。
　　 7、透射電鏡觀

24、察結(jié)果
　　 正常對照組肝細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，膜界限清晰，Disse隙正常，血竇面和膽小管面可見微絨毛伸入腔內(nèi)，肝細胞連接面可見緊密連接、縫隙連接等，細胞質(zhì)內(nèi)可見數(shù)量豐富且形態(tài)正常的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體復(fù)合體、核糖體，以及糖原顆粒、微小脂滴等內(nèi)含物，細胞核形狀規(guī)則且居中，核仁明顯;模型組肝細胞腫脹，胞漿中布滿眾多大小不一的脂滴空泡，Disse隙擴大且其中部分區(qū)域可見微絨毛和膠原纖維增生現(xiàn)象，偶見部分細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，線粒體輕

25、微腫脹;給藥組與模型組比較，均可見肝細胞內(nèi)脂滴空泡有不同程度的減少，各種細胞器以及細胞內(nèi)含物都沒有出現(xiàn)異?，F(xiàn)象，其中，辛伐他汀組肝細胞內(nèi)含少數(shù)脂滴;無患子高劑量（0.5g/kg）組肝細胞只含極少數(shù)脂滴，少數(shù)肝細胞有腫脹現(xiàn)象;無患子中(0.1g/kg)、低劑量組(0.05 g/kg)的肝細胞所含脂滴較多，部分細胞的Disse隙內(nèi)微絨毛和膠原纖維有增生現(xiàn)象。
　　 結(jié)論：
　　 1、無患子果實中呈肉質(zhì)部分為其果皮，而非假種皮

26、;在外層棕色的外果皮和內(nèi)層膜狀的內(nèi)果皮之間的細胞組織，為無患子的中果皮，存在于該部位的眾多大型溶生式分泌腔即為無患了富含皂苷類物質(zhì)的來源場所。
　　 2、無患子是一種具有兩重性的藥物，無患子皂苷具有療效同時具有一定毒性。急性毒性實驗結(jié)果顯示，當無患子醇提取物劑量≥1000mg/kg時，實驗動物（小鼠）在兩周內(nèi)開始出現(xiàn)不同程度中毒反應(yīng)，甚至死亡，推測皂苷類成分導(dǎo)致肝毒性損傷機制與機體氧化應(yīng)激誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化、組織內(nèi)巰基損耗而造成肝組

27、織損傷有關(guān)。
　　 3、通過常規(guī)檢測血清學指標和觀察肝臟病理變化可以看出，與模型組比較，無患子提取物各劑量組大鼠的肝濕重和肝指數(shù)均顯著降低(P＜0.05)，并能顯著降低血清中TC、TG、LDL、AST、ALT的含量，恢復(fù)提高血中HDL、APN水平;在光鏡下觀察到肝組織病理變化明顯有所改善，說明無患子乙醇提取物具有一定的調(diào)節(jié)血脂和防治脂肪肝的效果。
　　 4、通過掃描電鏡和透射電鏡觀察進一步可見脂肪肝大鼠的LSEC受損而使