無患子乙醇提取物抗非酒精性脂肪肝的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景
　　 肝臟是機(jī)體新陳代謝的重要器官，脂肪性肝病（Fatty liver disease）是指脂肪(主要是甘油三酯TG)在肝臟過度沉積的臨床病理綜合癥，其病理表現(xiàn)為單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纖維化和肝硬化。肝有門靜脈和肝動(dòng)脈雙重血供，但兩者最終都是通過終末微靜脈和微動(dòng)脈與肝血竇相連，完成與肝細(xì)胞的物質(zhì)交換后匯集于肝靜脈，因此肝竇是完成肝臟物質(zhì)交換的主要場(chǎng)所。而肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(Liver sinusoidal end

2、othelial cell LSEC)與肝枯否(kupffer)細(xì)胞是主要的肝竇狀隙細(xì)胞，且與肝內(nèi)物質(zhì)代謝及肝臟生理病理變化密切相關(guān)。LSEC受損，窗孔調(diào)節(jié)失控，如持續(xù)或過度擴(kuò)張可使原不能通過的富含甘油三酯的乳糜微粒(CM)被肝細(xì)胞攝取造成脂質(zhì)在肝細(xì)胞的堆積，引起急性脂肪肝。
　　 無患子（Sapindus mukorossi Gaertn）為無患子科無患子屬的一種落葉大喬木，其果實(shí)又名肥皂樹、洗手果或圓肥皂等，分布于我國長江流

3、域以南地區(qū)及臺(tái)灣省，日本、朝鮮、中南半島和印度等地也常栽培。無患子味苦，性寒，有小毒;具有清熱祛痰、消積殺蟲之功效。近年來，隨著對(duì)無患子研究的深入，其化學(xué)成分及其藥理作用已逐漸被發(fā)現(xiàn)，引起人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注。
　　 無患子作為中藥材在我國有悠久的使用歷史。據(jù)考證，無患子始載于《本草拾遺》，《植物名實(shí)圖考》亦有附圖，關(guān)于其藥用價(jià)值早在《本草綱目》中就有記載?，F(xiàn)代藥理基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，無患子具有多種生理活性和藥用價(jià)值，主要包括抗腫瘤、降

4、壓、抗菌、抗炎等，有報(bào)道表明無患子皂苷對(duì)高脂血癥大鼠血脂代謝有一定調(diào)節(jié)作用，但對(duì)無患子防治脂肪肝方面的研究尚未見報(bào)道。
　　 本研究的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無患子粗提物對(duì)大鼠脂肪肝的形成具有一定的干預(yù)作用。在此基礎(chǔ)上，本課題擬對(duì)無患子乙醇提取物的抗非酒精性脂肪肝作用進(jìn)行深入研究。
　　 本研究擬通過大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、

5、低密度脂蛋白(LDL)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）、堿性磷酸酶(ALP)、脂聯(lián)素(APN)含量等指標(biāo)的變化，以及運(yùn)用掃描電鏡和透射電鏡技術(shù)觀察正常和脂肪肝動(dòng)物肝竇狀隙細(xì)胞(LSEC)及kupffer細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量及功能的變化，探討分析肝竇狀隙細(xì)胞(LSEC)的變化與相關(guān)酶類和細(xì)胞因子表達(dá)的改變?cè)谥靖伟l(fā)病過程中的相關(guān)性，并給予中藥無患子進(jìn)行干預(yù)，進(jìn)一步探尋脂肪肝的發(fā)病機(jī)制及藥物作用靶點(diǎn)，為脂肪肝的防治提供新的思路與方法。
　　

6、 研究目的：
　　 1、對(duì)無患子入藥部位——無患子果皮進(jìn)行性狀和顯微鑒定，認(rèn)清無患子有效成分的物質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，為下一步篩選該藥活性成分（部位）提供理論依據(jù)。
　　 2、通過急性毒性實(shí)驗(yàn)，測(cè)定本課題所使用的無患子乙醇提取物對(duì)小鼠的半數(shù)致死量(LD50)，以保證實(shí)驗(yàn)用藥過程的安全性和有效性。
　　 3、通過檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清中轉(zhuǎn)氨酶、脂蛋白等生化指標(biāo)，以及觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝臟細(xì)胞、LSEC窗孔、kupffer細(xì)胞等與脂肪肝相

7、關(guān)的細(xì)胞因子的變化，初步探討這些酶類、細(xì)胞因子與肝竇狀隙細(xì)胞在脂肪肝發(fā)病過程中的相關(guān)性。
　　 4、采用藥物無患子醇提物進(jìn)行干預(yù)，驗(yàn)證其調(diào)節(jié)血脂、保肝護(hù)肝的療效，為進(jìn)一步探尋脂肪肝發(fā)病機(jī)制，尋找藥物作用靶點(diǎn)提供參考資料。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1、制作藥材顯微制片
　　 ①永久制片:無患子干燥果皮，按常規(guī)石蠟切片，番紅-固綠染色，中性樹膠封片。
　　 ②粉末裝片:無患子干燥果皮，65℃烘干1.5

8、h，粉碎后，取粉末制作水裝片和水合氯醛透化裝片。
　　 2、藥物提取液制備
　　 取無患子果皮，干燥粉碎后，第一次先用4倍量85％乙醇浸泡30min，90℃回流提取2h，收集提取液;第二次再用3倍量85％乙醇回流提取1.5h，兩次提取液過濾后合并，濃縮至1g/ml，于4℃保存?zhèn)溆谩?br>　　 3、急性毒性實(shí)驗(yàn)
　　 將KM小鼠60只，隨機(jī)分為6組，每組10只，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)，先適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。按小鼠急性毒

9、性實(shí)驗(yàn)常規(guī)方法，給藥前禁食不禁水12h，第1組至第6組分別按照500、1000、2000、3000、4000、5000mg/kg的劑量給藥，每天灌胃2次（0.8mL/只），每次相隔12h，給藥后觀察小鼠是否出現(xiàn)聳毛、蜷臥、耳殼蒼白或充血、突眼、步履蹣跚、肌肉癱瘓、呼吸困難、驚厥、昏迷、大小便失禁等毒性反應(yīng)，連續(xù)給藥觀察14天。
　　 4、脂肪肝動(dòng)物模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組
　　 將體重220±20g的健康SD大鼠飼養(yǎng)在20±

10、3℃自然光照環(huán)境下，取食飲水自由，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)，正常飼養(yǎng)1周后開始造模，每周統(tǒng)一時(shí)間稱量體重。實(shí)驗(yàn)分組:將48只實(shí)驗(yàn)SD大鼠隨機(jī)分分為正常對(duì)照組、模型組、辛伐他汀陽性對(duì)照組(7.2 mg/kg)、無患子提取物高、中、低劑量治療組(0.5、0.1、0.05g/kg)。除正常對(duì)照組投喂普通飼料，其他組均投喂高脂飼料連續(xù)6周，第4周開始同時(shí)對(duì)各藥物組大鼠以相應(yīng)藥物進(jìn)行灌胃（2mL/只），正常對(duì)照組和模型組灌胃等體積蒸餾水;第42天17:

11、00后禁食不禁水，第43天8:00處死實(shí)驗(yàn)大鼠采集血液和肝臟標(biāo)本。
　　 5、血清中生化指標(biāo)以及肝功能指標(biāo)的檢測(cè)
　　 第43天，把實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用10％水合氯醛(3mL/kg)麻醉后通過腹主動(dòng)脈取血4～5mL，經(jīng)3000r/min×15min離心，取上層血清，立即將大鼠血清樣本送至南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測(cè)AST、ALT、TC、TG、HDL-C、LDL-C、γ-GT、ALP、APN含量，脂聯(lián)素(APN)按試劑盒指示

12、進(jìn)行操作。
　　 6、病理切片、電鏡樣本的制備與觀察
　　 ①病理切片:取出肝臟后，稱濕質(zhì)量，計(jì)算肝指數(shù)，并在肝右葉離邊緣1cm處，橫切一塊肝組織（約3mm×3mm×10mm）用10％中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，HE染色。
　　 ②掃描電鏡:大鼠在體從肝門靜脈插管，經(jīng)0.9％生理鹽水沖洗，灌注液滴注，待血液從下腔靜脈切口流出至肝組織無血色停止灌注，取一塊肝組織（部位、大小同上）浸泡于電鏡用戊二醛中固定，4℃保存，

13、再經(jīng)逐級(jí)脫水，CO2臨界點(diǎn)干燥，噴鍍Pt，用掃描電鏡觀察肝組織結(jié)構(gòu)及LSEC上窗孔的數(shù)目和大小。
　　 ③透射電鏡:取出大鼠新鮮肝組織（部位同上、約1 mm3），浸泡于電鏡用戊二醛中固定，4℃保存，經(jīng)逐級(jí)脫水，用環(huán)氧樹脂Epon812包埋劑37℃浸透并聚合包埋，修整后逐層切薄片，染色干燥后，用透射電鏡觀察肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)及其細(xì)胞器的數(shù)目和形態(tài)。
　　 7、統(tǒng)計(jì)方法
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分

14、析，半數(shù)致死量(LD50)應(yīng)用SPSS13.0軟件中的Probit模塊（概率單位回歸）求出;計(jì)量資料采用One-WayANOVA方差分析，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±s）表示，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;等級(jí)資料采用K Independent Samples非參數(shù)檢驗(yàn)，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、無患子果皮顯微鑒定
　　 ①外果皮為2～4層細(xì)小的類方形表皮細(xì)胞，外被較厚角質(zhì)層，內(nèi)含紅棕

15、色物質(zhì)呈柵欄狀排列;中果皮靠近表皮一側(cè)具有6～10層厚角細(xì)胞，內(nèi)含棕色物質(zhì)，其內(nèi)側(cè)為薄壁細(xì)胞和大量溶生式分泌腔，可見眾多草酸鈣簇晶、方晶、石細(xì)胞夾雜其中，外韌型維管束稀疏分布，韌皮部外側(cè)有木化的纖維束;內(nèi)果皮細(xì)胞4～5層極扁平的木化細(xì)胞，緊密層疊。
　　 ②粉末棕色，極粘稠。外果皮細(xì)胞表面觀呈不規(guī)則圓形，含棕色物質(zhì)，直徑20μm～25μm，細(xì)胞壁厚;草酸鈣簇晶散在，直徑12μm～35μm;內(nèi)果皮細(xì)胞狹長，寬約10μm，以長軸方向

16、在不同細(xì)胞層嵌列，可見方晶鑲嵌其中;纖維多為成束的晶鞘纖維，直徑10μm～15μm;可見螺紋導(dǎo)管、石細(xì)胞單個(gè)散在。
　　 2、急性毒性實(shí)驗(yàn)
　　 在2周給藥時(shí)間內(nèi)，第1組小鼠(500mg/kg)表現(xiàn)正常，無死亡記錄;第2組小鼠(1000mg/kg)服藥后，出現(xiàn)輕微脫毛，且活動(dòng)能力稍有減弱，2周內(nèi)死亡4只;第3組（2000mg/kg）與第4組小鼠(3000mg/kg)服藥后出現(xiàn)不同程度的脫毛，生存小鼠精神萎靡，活動(dòng)力差，經(jīng)

17、常瞇眼，蜷臥嗜睡，食欲不振，灌胃時(shí)躁動(dòng)不安，分別于第1周死亡4只和5只;第5組小鼠(4000mg/kg)出現(xiàn)較大面積脫毛現(xiàn)象，生存小鼠鼻腔周圍抽搐或出血，呼吸急促，行動(dòng)不協(xié)調(diào)，且大便量少，呈黑色黏稠狀，第1周內(nèi)死亡6只，尸體鼻腔有血跡;第6組小鼠(5000mg/kg)于3天內(nèi)全部死亡，尸體皮膚發(fā)暗，口腔或鼻腔有血跡，剖開腹部發(fā)現(xiàn)其消化道腫脹，胃腸道內(nèi)充滿氣泡狀液體，其他內(nèi)臟器官顏色發(fā)黑。
　　 3、各組體重和肝指數(shù)
　　

18、 與正常對(duì)照組比較，模型組處死前體重顯著降低，肝濕重以及肝指數(shù)顯著升高(P＜0.05或P＜0.01)，說明脂肪肝造模成功;與模型組比較，各個(gè)給藥組大鼠的肝濕重和肝指數(shù)均顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，說明藥物對(duì)脂肪肝模型有一定防治作用。
　　 4、血脂生化檢測(cè)結(jié)果
　　 與正常對(duì)照組比較，模型組血清中TC、TG、LDL-C、AST、ALT、γ-GT、ALP均顯著升高(P＜0.01)， HDL-C、APN顯著降低(

19、P＜0.05或P＜0.01);與模型組比較，辛伐他汀組和無患子高劑量組(0.5g/kg)均能降低血清中TC、TG、LDL-C、AST、ALT并升高HDL-C和APN(P＜0.05或P＜0.01)，但對(duì)降低γ-GT和ALP，無患子各劑量組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 5、光鏡觀察結(jié)果
　　 正常對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝索排列整齊，肝細(xì)胞大小均勻，多數(shù)肝細(xì)胞見一個(gè)細(xì)胞核，部分可見雙核，肝竇清晰，匯管區(qū)無炎癥細(xì)胞浸潤;模型組多數(shù)肝

20、小葉結(jié)構(gòu)輪廓消失，肝細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，多數(shù)腫脹，內(nèi)含大空泡狀脂滴把核擠到一側(cè)，甚者相間氣球樣變，肝竇不清晰，部分肝細(xì)胞出現(xiàn)點(diǎn)狀或片狀壞死，可見炎癥細(xì)胞浸潤;辛伐他汀組部分肝細(xì)胞腫脹、少數(shù)含小泡狀脂滴;無患子高劑量組(0.5g/kg)肝細(xì)胞大小均勻，形態(tài)正常，少數(shù)肝細(xì)胞腫脹或含脂滴，肝竇清晰;無患子中劑量組（0.1g/kg）部分肝細(xì)胞腫脹并含脂滴，肝竇變窄;無患子低劑量組(0.05g/kg)部分肝細(xì)胞腫脹含脂滴，可見局灶性壞死。
　　

21、 6、掃描電鏡觀察結(jié)果
　　 ①肝組織結(jié)構(gòu)形態(tài)變化:正常對(duì)照組肝細(xì)胞索呈放射狀整齊排列，肝竇結(jié)構(gòu)清晰，膠原纖維數(shù)量及形態(tài)正常，貯脂細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常;模型組幾乎所有肝細(xì)胞出現(xiàn)腫脹且大部分含脂滴，肝竇結(jié)構(gòu)不明顯，膠原纖維明顯增生，貯脂細(xì)胞脂滴增多明顯;辛伐他汀組肝細(xì)胞索排列規(guī)則，肝竇結(jié)構(gòu)清晰，偶見含脂滴肝細(xì)胞;無患子高劑量組（0.5g/kg）肝細(xì)胞輕度腫脹，偶見含小泡脂滴的肝細(xì)胞，局部區(qū)域有少數(shù)膠原纖維增生;無患子中劑量組(0.1g/

22、kg)肝細(xì)胞可見含脂滴肝細(xì)胞，膠原纖維稍有增生;無患子低劑量組(0.05g/kg)明顯可見大部分肝細(xì)胞含大小不一的泡狀脂滴，且膠原纖維明顯增生。
　　 ②LSEC窗孔形態(tài)變化:正常對(duì)照組LSEC表面有一定數(shù)量的正常形態(tài)的窗孔(Φ0.05μm～0.2μm)以簇狀排列呈篩孔狀均勻分布;模型組LSEC表面的窗孔（Φ0.3μm～1.2μm）相互融合而失去篩孔結(jié)構(gòu)，每個(gè)窗孔都顯著擴(kuò)張而使LSEC胞體趨于破裂欲脫落狀，可見LSEC下方腫脹的

23、肝細(xì)胞表面有微絨毛暴露;與正常對(duì)照組比較，辛伐他汀組窗孔(Φ0.05μm～0.2μm)數(shù)量、大小、形態(tài)與正常對(duì)照組接近;無患子高劑量組(Φ0.1μm～0.5μm)局部窗孔稍微擴(kuò)張，但大部分形態(tài)仍保持正常;無患子中劑量組(Φ0.1μm～0.8μm)、無患子低劑量組(Φ0.2μm～1μm) LSEC窗孔分布雜亂，部分篩孔狀結(jié)構(gòu)互相連通成大窗孔，LSEC下方肝細(xì)胞表面的微絨毛暴露，但仍有小部分局域窗孔保持篩孔狀。
　　 7、透射電鏡觀

24、察結(jié)果
　　 正常對(duì)照組肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，膜界限清晰，Disse隙正常，血竇面和膽小管面可見微絨毛伸入腔內(nèi)，肝細(xì)胞連接面可見緊密連接、縫隙連接等，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見數(shù)量豐富且形態(tài)正常的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體復(fù)合體、核糖體，以及糖原顆粒、微小脂滴等內(nèi)含物，細(xì)胞核形狀規(guī)則且居中，核仁明顯;模型組肝細(xì)胞腫脹，胞漿中布滿眾多大小不一的脂滴空泡，Disse隙擴(kuò)大且其中部分區(qū)域可見微絨毛和膠原纖維增生現(xiàn)象，偶見部分細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，線粒體輕

25、微腫脹;給藥組與模型組比較，均可見肝細(xì)胞內(nèi)脂滴空泡有不同程度的減少，各種細(xì)胞器以及細(xì)胞內(nèi)含物都沒有出現(xiàn)異常現(xiàn)象，其中，辛伐他汀組肝細(xì)胞內(nèi)含少數(shù)脂滴;無患子高劑量（0.5g/kg）組肝細(xì)胞只含極少數(shù)脂滴，少數(shù)肝細(xì)胞有腫脹現(xiàn)象;無患子中(0.1g/kg)、低劑量組(0.05 g/kg)的肝細(xì)胞所含脂滴較多，部分細(xì)胞的Disse隙內(nèi)微絨毛和膠原纖維有增生現(xiàn)象。
　　 結(jié)論：
　　 1、無患子果實(shí)中呈肉質(zhì)部分為其果皮，而非假種皮

26、;在外層棕色的外果皮和內(nèi)層膜狀的內(nèi)果皮之間的細(xì)胞組織，為無患子的中果皮，存在于該部位的眾多大型溶生式分泌腔即為無患了富含皂苷類物質(zhì)的來源場(chǎng)所。
　　 2、無患子是一種具有兩重性的藥物，無患子皂苷具有療效同時(shí)具有一定毒性。急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)無患子醇提取物劑量≥1000mg/kg時(shí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（小鼠）在兩周內(nèi)開始出現(xiàn)不同程度中毒反應(yīng)，甚至死亡，推測(cè)皂苷類成分導(dǎo)致肝毒性損傷機(jī)制與機(jī)體氧化應(yīng)激誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化、組織內(nèi)巰基損耗而造成肝組

27、織損傷有關(guān)。
　　 3、通過常規(guī)檢測(cè)血清學(xué)指標(biāo)和觀察肝臟病理變化可以看出，與模型組比較，無患子提取物各劑量組大鼠的肝濕重和肝指數(shù)均顯著降低(P＜0.05)，并能顯著降低血清中TC、TG、LDL、AST、ALT的含量，恢復(fù)提高血中HDL、APN水平;在光鏡下觀察到肝組織病理變化明顯有所改善，說明無患子乙醇提取物具有一定的調(diào)節(jié)血脂和防治脂肪肝的效果。
　　 4、通過掃描電鏡和透射電鏡觀察進(jìn)一步可見脂肪肝大鼠的LSEC受損而使