RNA干擾沉默Aurora-A表達(dá)與激活PKR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)治療宮頸癌的探索性研究.pdf

1、研究背景：
　　宮頸癌是婦科高發(fā)惡性腫瘤，雖然宮頸癌的防治已取得很大成效，但近年來由于宮頸癌的發(fā)病率明顯增高，目前，宮頸癌的治療采用以手術(shù)和放射治療為主，同時(shí)輔以化療的綜合治療，因此不可避免的會(huì)給患者，尤其是尚未生育的育齡婦女帶來巨大痛苦。如何更加安全、有效地早期預(yù)防宮頸癌發(fā)生；在常規(guī)手術(shù)的基礎(chǔ)上，增加宮頸癌放、化療敏感性，成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。
　　近20年來，有關(guān)宮頸癌研究的最大進(jìn)展即證明了HPV感染同宮頸癌發(fā)生關(guān)系

2、密切。在所有宮頸癌病例中，明確由HPV16、18型引起的分別占總體的60％和72％，而99.7％的宮頸癌組織中存在HPVDNA。因此，從病因?qū)W講，宮頸癌是可預(yù)防、可阻斷、可治療的。
　　目前，國內(nèi)外有關(guān)宮頸癌生物治療的研究多從如何有效預(yù)防、治療HPV感染的角度著手。高危型HPV16、18的E6、E7蛋白疫苗、L1病毒樣顆粒疫苗已經(jīng)問世，到2006年1月份為止，超過3000例患者參與的大規(guī)模Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)已在國外相繼完成，HPV疫苗對

3、宮頸上皮內(nèi)瘤樣變（CIN）的預(yù)防及治療有效率可達(dá)到95％～100％，顯示了良好的治療前景。但就目前而言，HPV疫苗在安全性、免疫源性、HLA相容性、經(jīng)濟(jì)性等方面也存在著一些不可回避的問題；另外，HPV疫苗的安全性評價(jià)得經(jīng)過最少25年的臨床觀察才能給予最終定論。因此，以治療HPV感染為切入點(diǎn)的針對宮頸癌的治療的研究尚未取得突破性進(jìn)展，仍需要進(jìn)一步補(bǔ)充和完善。
　　PKR是一種廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通常在細(xì)

4、胞中以潛在和非激活狀態(tài)存在，但可以被低濃度的雙鏈RNA（dsRNA）如病毒復(fù)制過程中產(chǎn)生的dsRNA所激活，進(jìn)而磷酸化其底物真核起始因子的α亞基(eIF-2α)，磷酸化的eIF-2α抑制蛋白質(zhì)合成，包括病毒蛋白的合成，誘導(dǎo)被感染細(xì)胞凋亡，在控制病毒復(fù)制中起著非常重要的作用。
　　最近證實(shí)，PKR同時(shí)是一個(gè)重要的凋亡效應(yīng)子，所以一些研究者開始關(guān)注是否PKR的調(diào)節(jié)是一種新的抗腫瘤策略。研究發(fā)現(xiàn)：PKR能被轉(zhuǎn)錄因子E2F-1直接誘導(dǎo)上調(diào)

5、，也能通過與某些細(xì)胞因子直接的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用而活化；另外，通過轉(zhuǎn)染與腫瘤特異RNA序列互補(bǔ)的反義RNA而形成細(xì)胞內(nèi)的dsRNA，能誘導(dǎo)PKR活化和選擇性針對這些腫瘤細(xì)胞的凋亡。預(yù)示了PKR用于抗腫瘤治療新靶點(diǎn)的美好前景。
　　目前，關(guān)于宮頸癌中PKR、以及下游通路中重要功能蛋白eIF-2α的表達(dá)與活化水平還缺乏實(shí)質(zhì)性的研究成果及文獻(xiàn)報(bào)道。我們通過預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：未受到HPV病毒感染的宮頸癌細(xì)胞中，PKR的表達(dá)與活化與其他腫瘤中

6、的情況完全一致；在受到HPV感染的宮頸癌組織及細(xì)胞中，無活性PKR的表達(dá)與其他腫瘤中報(bào)道的情況相同，處于高表達(dá)水平，但其活性狀態(tài)——磷酸化PKR卻受到嚴(yán)重抑制。因此我們推斷，①由于受到特殊病原體HPV的影響，PKR在宮頸癌組織中活化能力下降，進(jìn)而限制其抵抗病毒感染、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用；②如果能采用導(dǎo)入dsRNA的方法將其激活，打破與HPV病毒間的相對“平衡”，將產(chǎn)生強(qiáng)大的抗病毒與抗腫瘤效果。
　　然而對肝炎等與病毒密切相關(guān)疾病

7、研究發(fā)現(xiàn)，由于病毒表達(dá)不同蛋白成分對PKR的負(fù)調(diào)控作用，使得PKR對長鏈dsRNA的應(yīng)答反應(yīng)表現(xiàn)不一。結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)的發(fā)現(xiàn)，我們認(rèn)為，如果選擇其他的治療靶位聯(lián)合激活PKR途徑的策略，勢必將達(dá)到治療宮頸癌更優(yōu)的效果。同時(shí)，如果靶位選擇得當(dāng)，PKR誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡也能夠具有相對的特異性。
　　Aurora-A激酶在正常表達(dá)水平具有調(diào)節(jié)中心體、微管功能，從而對有絲分裂起關(guān)鍵作用。但在其發(fā)生過度表達(dá)時(shí)通常伴隨腫瘤發(fā)生，并且表達(dá)水平與腫瘤的臨

8、床分期、細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)移等情況密切相關(guān)。但它與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系目前尚未見報(bào)道。
　　在食道癌與HPV的研究中證實(shí)，HPV能夠上調(diào)Aurora-A的表達(dá)；其他實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Aurora-A在過度表達(dá)后通過抑制p53等蛋白功能，造成細(xì)胞周期檢查點(diǎn)功能缺陷，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生永生化。而p53是PKR通路發(fā)揮抗腫瘤作用的重要途徑；在國內(nèi)外針對Aurora-A聯(lián)合其他靶位用于腫瘤治療的研究中，已有成功的先例。因此，我們推斷：在與HPV病毒感染關(guān)系

9、密切的宮頸癌中，Aurora-A極有可能出于過度表達(dá)狀態(tài)；如果抑制Aurora-A過表達(dá)，保護(hù)p53的正常功能狀態(tài)，將更好的發(fā)揮PKR通路的作用；同時(shí)，由于Aurora-A的過度表達(dá)僅發(fā)生于增殖速度明顯異常的細(xì)胞，因此，針對Aurora-A的靶向治療，具有一定的腫瘤特異性。
　　研究目的：
　　1.從細(xì)胞水平和組織水平明確PKR在宮頸不同病理狀態(tài)下表達(dá)的差異與活性狀態(tài)；
　　2.了解宮頸正常與癌變情況下Aurora-A

10、蛋白的表達(dá)水平，并結(jié)合病例分析，探討其與宮頸癌的關(guān)系；
　　3.探討RNAi策略阻斷抑制Aurora-A蛋白表達(dá)對宮頸治療的可行性；4.探討小片段RNA激活PKR通路的可能性與實(shí)用價(jià)值。
　　研究方法：
　　1.利用免疫組化、Westernblotting、實(shí)時(shí)定量PCR等方法檢測不同病理狀態(tài)下宮頸組織，及不同宮頸細(xì)胞株中PKR通路中上游調(diào)節(jié)蛋白及下游主要作用產(chǎn)物的水平，研究在宮頸病變逐漸演進(jìn)中PKR通路的表達(dá)水平與活

11、性狀態(tài)。
　　2.利用免疫組化、Westernblotting、實(shí)時(shí)定量PCR等方法檢測正常宮頸組織與宮頸癌組織標(biāo)本中Aurora-A蛋白的表達(dá)差異，并結(jié)合病例資料分析，明確Aurora-A與宮頸癌的關(guān)系。
　　3.使用RNA干擾的手段對Hela細(xì)胞中Aurora-A基因?qū)嵤┨禺愋砸种疲⑼ㄟ^Westernblotting、實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測其抑制效率。
　　4.對已構(gòu)建的Aurora-A的siRNA序列進(jìn)行修飾

12、，并再次轉(zhuǎn)染細(xì)胞，觀察其抑制效率及對PKR通路的激活能力。使用MTT方法比較常規(guī)設(shè)計(jì)的siRNA及修飾后的siRNA對Hela細(xì)胞增殖抑制的能力。
　　研究結(jié)果：
　　1.正常宮頸、CINI、CINII、CINIII、宮頸鱗狀上皮癌、宮頸腺癌組織中均有PKR及其通路中多個(gè)蛋白的表達(dá)，表達(dá)存在不同程度差異，并且與HPV感染有關(guān)；
　　2.在未感染HPV病毒的宮頸癌細(xì)胞株C33A中，PKR蛋白的表達(dá)與活化處于較高水平，最終

13、體現(xiàn)在作用底物eIF-2α處于較高的活性狀態(tài)；此發(fā)現(xiàn)與目前報(bào)道的PKR在其他腫瘤中的表達(dá)相一致；
　　3.由于HPV病毒的影響，宮頸癌組織以及HPV（+）的宮頸癌細(xì)胞系中，PKR通路中的各種功能蛋白在宮頸癌中的表達(dá)與現(xiàn)已報(bào)道的大多數(shù)腫瘤中的表達(dá)有較大差異；實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，HPV能夠通過以下途徑抑制PKR通路：在轉(zhuǎn)錄水平降低PKRmRNA的表達(dá)；提高PKR抑制物p58IPK的水平；降低PKR激活物PACT的表達(dá)，抑制PKR的活化；并通過

14、直接和間接的途徑抑制其作用底物eIF-2α的活化過程。
　　4.在人類宮頸癌組織中存在Aurora-A過度表達(dá)的情況，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也證明，宮頸癌細(xì)胞株中Aurora-A表達(dá)明顯升高；
　　5.經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)Aurora-A的過度表達(dá)與宮頸癌發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，其中與腫瘤的FIGO分期、腫瘤細(xì)胞分化程度、癌腫浸潤程度以及有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等因素呈正相關(guān)關(guān)系；而與年齡、腫瘤類型等情況無相關(guān)關(guān)系；
　　6.成功構(gòu)建Aurora-

15、A的siRNA片段，并通過實(shí)時(shí)定量PCR證實(shí)抑制了Aurora-A的mRNA表達(dá)，蛋白印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)蛋白表達(dá)水平下降，綜合說明構(gòu)建的常規(guī)siRNA片段有明顯抑制Aurora-A蛋白表達(dá)的效果；
　　7.MTT實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染了Aurora-AsiRNA的Hela細(xì)胞增殖受到明顯抑制，證實(shí)Aurora-A能夠用于宮頸癌治療的潛力；
　　8.成功構(gòu)建了用于干涉Aurora-A含polyA尾的siRNA，將其轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后，實(shí)時(shí)定量P

16、CR和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)說明同樣對Aurora-A蛋白具有抑制作用；
　　9.通過蛋白印跡實(shí)驗(yàn)，證實(shí)修飾后的siRNA片段具有激活PKR系統(tǒng)的能力，但是作用較微弱；
　　10.MTT實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染了修飾后siRNA的Hela細(xì)胞增殖水平比轉(zhuǎn)染常規(guī)siRNA細(xì)胞的更低，可能是被激活的PKR系統(tǒng)非特異的抑制細(xì)胞蛋白合成的結(jié)果。
　　結(jié)論：
　　1.通過對各個(gè)功能蛋白的分析，我們認(rèn)為，PKR通路的調(diào)控與HPV病毒有密切關(guān)系；由

17、于宮頸癌普遍合并HPV病毒的感染，因而表現(xiàn)出與目前已經(jīng)報(bào)道的人類大多數(shù)腫瘤中PKR的高表達(dá)不一致；
　　2.人類宮頸癌由于同時(shí)兼有腫瘤和特殊病原體感染的特性，使PKR通路表現(xiàn)出更復(fù)雜的多樣性；因此，在與HPV密切相關(guān)的宮頸癌組織中，有豐富的PKR被嚴(yán)重抑制，處于無功能狀態(tài)，如能打破這種相對平衡，將充分發(fā)揮PKR通路的抗病毒與抗腫瘤作用；
　　3.Aurora-A蛋白過度表達(dá)于子宮頸癌中，并且其過度表達(dá)的狀態(tài)與宮頸癌的預(yù)后密切

18、相關(guān)；
　　4.RNA干涉后造成Aurora-A蛋白表達(dá)下降，并抑制宮頸癌Hela細(xì)胞株的增殖，顯示出干涉Aurora-A表達(dá)用于宮頸癌治療的潛力；
　　5.通過對小干擾RNA進(jìn)行修飾的手段，可能會(huì)使siRNA獲得對PKR的激活能力；聯(lián)合激活PKR通路與抑制Aurora-A蛋白過度表達(dá)的方式具有更強(qiáng)的抑制細(xì)胞增殖的作用；
　　6.在siRNA反義鏈3，端加入polyA時(shí)可以出現(xiàn)對PKR較弱的激活作用，但其機(jī)制與實(shí)用性尚