PKR-EIF2α信號(hào)傳導(dǎo)通路與宮頸癌關(guān)系研究.pdf

1、目的:
　　 探討HPV（16/18）E6蛋白對(duì)PKR/EIF2a信號(hào)傳導(dǎo)通路中PKR、p-PKR、p-EIF2a在各級(jí)別宮頸病變組織的定位及表達(dá)的影響，四者的表達(dá)差異與宮頸病變級(jí)別的相關(guān)性及對(duì)宮頸癌患者預(yù)后的影響；設(shè)計(jì)并構(gòu)建以HPV18E6癌基因及無(wú)關(guān)序列（NC序列）為靶點(diǎn)的shRNA干擾序列的慢病毒載體（HPV18E6-RNAi-LV，NC-GFP-LV）；以HPV18E6-RNAi-LV及NC-GFP-LV為工具轉(zhuǎn)染HeL

2、a細(xì)胞，研究在干擾HPV18E6癌基因表達(dá)的基礎(chǔ)上，篩選出可能參與調(diào)節(jié)PKR/EIF2a信號(hào)傳導(dǎo)通路活性的靶分子，為進(jìn)一步探索高效激活PKR/EIF2a信號(hào)傳導(dǎo)通路的方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 第一部分：采用免疫組化法檢測(cè)HPV（16/18）E6、PKR、p-PKR、p-EIF2a在63例宮頸癌、114例宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變（CINⅠ～CINⅢ）、15例正常宮頸組織中的定位及表達(dá)，分析HPV（16/18）E6蛋

3、白對(duì)PKR/EIF2a信號(hào)傳導(dǎo)通路活性的影響，四者在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，對(duì)宮頸癌患者預(yù)后的影響。
　　 第二部分：根據(jù)目的基因的相關(guān)信息，構(gòu)建含有shRNA的重組質(zhì)粒載體并鑒定：提取和純化高質(zhì)量的不含內(nèi)毒素的重組質(zhì)粒：將重組質(zhì)粒載體和病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行病毒包裝，收集病毒液并進(jìn)行濃縮、純化；所得病毒液感染293T細(xì)胞，測(cè)定病毒滴度。
　　 第三部分：使用HPV18E6-RNAi-LV及NC-GFP-

4、LV慢病毒載體轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，以RT-PCR、Western Blot法分別在核酸、蛋白水平（包括磷酸化型）檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后HPV18E6、PKR、EIF2a、NF-κBp65、STAT1、MAPK、JNK1的表達(dá)，篩選出可能參與調(diào)節(jié)PKR/EIF2a信號(hào)傳導(dǎo)通路活性的靶分子；以MTT法、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后宮頸癌HeLa細(xì)胞活性及侵襲能力的變化。
　　 結(jié)果:
　　 第一部分
　　 1、HPV（

5、16/18）E6蛋白主要定位于細(xì)胞核中，PKR、p-PKR、p-EIF2a蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)中；
　　 2、HPV（16/18）E6蛋白與PKR在各組的陽(yáng)性表達(dá)率隨宮頸病變級(jí)別升高而升高，并與宮頸病變級(jí)別呈正相關(guān)（P<0.05）；P-PKR、P-EIF2a在各組的陽(yáng)性表達(dá)率隨宮頸病變級(jí)別升高而先升高、后下降；在宮頸癌組，PKR的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于P-PKR（P<0.01）；
　　 3、宮頸癌患者臨床分期晚者病情進(jìn)展快（

6、P<0.01），HPV（16/18）E6陽(yáng)性表達(dá)者病情進(jìn)展快（P<0.05），p-PKR、P-EIF2a陰性表達(dá)者病情進(jìn)展快（P<0.05，P<0.05）。
　　 第二部分
　　 1、經(jīng)BLASTER同源性檢索，HPV18E6的shRNA干擾序列與人類(lèi)基因組沒(méi)有同源性。HPV18E6、NC序列的shRNA干擾序列的正反義鏈轉(zhuǎn)錄后得到的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)能形成環(huán)狀發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)；
　　 2、攜帶HPV18E6、NC序列的s

7、hRNA序列陽(yáng)性克隆經(jīng)測(cè)序鑒定比對(duì)后，陽(yáng)性克隆即為構(gòu)建成功的慢病毒載體：
　　 3、成功進(jìn)行慢病毒包裝、收獲及濃縮，經(jīng)慢病毒滴度測(cè)定，HPV18E6-RNAi-LV滴度：3E+8 TU/ml NC-GFP-LV滴度：2E+9 TU/ml。
　　 第三部分
　　 1、轉(zhuǎn)染組HPV18E6、NF-κBp65 mRNA表達(dá)量明顯低于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組（p<0.05，p<0.05）；轉(zhuǎn)染組PKR mRNA表達(dá)量明顯高

8、于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組（p<0.05）；EIF2a、STAT1、MAPK、JNK1 mRNA表達(dá)量在各組間的比較無(wú)顯著性差異（p>0.05）；
　　 2、轉(zhuǎn)染組HPV18E6、NF-κBp65蛋白的表達(dá)量明顯低于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組（p<0.05，p<0.05）；轉(zhuǎn)染組P-STAT1、PKR蛋白的表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組（p<0.05，p<0.05）；轉(zhuǎn)染組P-PKR、p-EIF2a蛋白的表達(dá)量顯著高于空白對(duì)照組

9、及陰性對(duì)照組（p<0.01，p<0.01）；STAT1、MAPK、P-MAPK、JNK1、p-JNK1蛋白的表達(dá)量在各組間的比較無(wú)顯著性差異（p>0.05）；
　　 3、轉(zhuǎn)染組細(xì)胞活性抑制率39.6％，細(xì)胞侵襲抑制率56.2％，明顯高于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組（p<0.05，p<0.05），空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較，無(wú)顯著性差異（p>0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1、HPV（16/18）E6蛋白能通過(guò)使p-P

10、KR、p-EIF2a去磷酸化的方式抑制PKR/EIF2a信號(hào)傳導(dǎo)通路激活，阻止病變細(xì)胞凋亡，促進(jìn)宮頸病變進(jìn)展；PKR/EIF2a信號(hào)傳導(dǎo)通路有效激活，能夠抑制宮頸癌患者病情進(jìn)展，改善其預(yù)后；
　　 2、成功構(gòu)建了HPV18E6-RNAi-LV和NC-GFP-LV慢病毒載體，為后續(xù)研究工作提供了實(shí)驗(yàn)工具。
　　 3、降低HPV18E6癌基因的表達(dá)水平可增加PKR的表達(dá)，恢復(fù)PKR/EIF2a信號(hào)傳導(dǎo)通路活性，抑制HeLa細(xì)