南蛇藤素抑制TLR4-MMP-9通路抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞侵襲的研究.pdf

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種進(jìn)展性自身免疫性疾病，主要累及關(guān)節(jié)，以滑膜增殖以及炎性細(xì)胞浸潤為特征，最終導(dǎo)致組織破壞與殘疾?；こ衫w維細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LSs)在RA的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，其與其他免疫炎性細(xì)胞共同作用，通過分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(metalloproteinases，MMPs)到滑膜液中，并且直接遷徙至細(xì)胞外基質(zhì)(extracell

2、ular matrix，ECM)中導(dǎo)致關(guān)節(jié)骨與軟骨破壞。FLS侵襲正成為RA治療的新靶點。MMPs與RA的發(fā)展密切相關(guān)，并且是FLS侵襲的重要因素。MMPs主要由促炎細(xì)胞因子活化Toll樣受體4(Toll-like receptor4，TLR4)/核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor-κB，NF-κB)等炎癥信號通路，促進(jìn)RA-FLS分泌。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性菌的細(xì)胞膜成分，研究發(fā)現(xiàn)其可

3、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移。TLR4是LPS的受體，RA-FLS也固有表達(dá)TLR4。迄今，TLR4在RA-FLS侵襲中的作用及調(diào)控機(jī)制如何，尚無報道。
　　南蛇藤素(celastrol，Cel)是從南蛇藤中提取的中藥單體，既往對其研究多集中于抗腫瘤。中草藥中的有效成分通常較傳統(tǒng)抗RA西藥具有更低的毒性和更好的藥物耐受性，迄今，許多抗RA中草藥的作用機(jī)制尚未完全明確。最近，研究報道南蛇藤素可抑制佐劑誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠關(guān)節(jié)破壞。目前已

4、知的南蛇藤素抗RA的機(jī)制包括抗炎、抑制免疫細(xì)胞浸潤、抑制滑膜細(xì)胞增殖、免疫調(diào)節(jié)、抑制破骨細(xì)胞活化等。但是，南蛇藤素對RA-FLS侵襲的作用和具體機(jī)制如何，目前尚未闡明。
　　在本研究中，我們觀察南蛇藤素對LPS誘導(dǎo)的人RA-FLS遷徙與侵襲能力的影響;進(jìn)一步探討南蛇藤素抑制RA-FLS遷徙與侵襲的可能機(jī)制及作用靶點，并在體內(nèi)水平探討南蛇藤素對膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎大鼠(collagen-induced arthritis，CIA)滑膜炎

5、癥及關(guān)節(jié)破壞的影響及可能機(jī)制。研究內(nèi)容共分為四部分:
　　第一部分南蛇藤素對LPS誘導(dǎo)的RA-FLS侵襲的影響
　　目的:為觀察南蛇藤素（celastrol，Cel）對脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞(rheumatoid arthritis fibroblast-likesynoviocyte，RA-FLS)遷徙與侵襲能力的影響。
　　方法:從RA患者的滑膜體外分

6、離培養(yǎng)FLSs，流式細(xì)胞術(shù)鑒定表面標(biāo)志(CD14及CD68是巨噬細(xì)胞標(biāo)記，CD90是成纖維細(xì)胞標(biāo)記)。使用不同濃度的Cel處理RA-FLS24 h，MTT法檢測細(xì)胞活力。Transwell小室檢測Cel對LPS誘導(dǎo)的RA-FLS遷徙與侵襲能力的影響。
　　結(jié)果:成功分離培養(yǎng)RA-FLS，利用流式細(xì)胞術(shù)，聯(lián)合巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記(CD14和CD68)和成纖維細(xì)胞表面標(biāo)記(CD90)進(jìn)行鑒定RA-FLS。研究發(fā)現(xiàn)，第3代以后CD14及CD

7、68表達(dá)率＜1％，CD90表達(dá)率＞98％，選取第3代～6代細(xì)胞進(jìn)行實驗。0.05μM到0.2μM的Cel作用24 h及48 h后對RA-FLS活力無明顯影響。但是，較正常對照組相比，0.4μM與0.8μM的Cel可減少細(xì)胞活力約1倍與2倍。與正常對照組相比，LPS刺激24 h，F(xiàn)LS遷徙能力可增加約3.05倍，與之相似，F(xiàn)LS侵襲能力可增加約7.02倍。Cel可呈濃度依賴性的抑制LPS誘導(dǎo)的RA-FLS遷徙與侵襲。
　　結(jié)論:這些

8、結(jié)果表明非細(xì)胞毒濃度的Cel（0.05μM～0.2μM）可以抑制LPS誘導(dǎo)的RA-FLS遷徙與侵襲，Cel可能通過抑制LPS誘導(dǎo)的RA-FLS遷徙與侵襲達(dá)到抗RA的治療作用。
　　第二部分南蛇藤素抑制MMP-9介導(dǎo)的RA-FLS侵襲的研究
　　目的:為探討Cel是否通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(metalloproteinases，MMPs)活性達(dá)到抗LPS誘導(dǎo)的RA-FLS遷徙與侵襲作用。
　　方法:利用熒光實時定量PCR

9、(quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR)及Western Blot檢測不同濃度的Cel(0.05μM，0.1μM，0.2μM)對LPS刺激下RA-FLS上相關(guān)MMPs表達(dá)的影響;收集細(xì)胞上清，使用酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)及明膠酶譜方法分析Cel對LPS刺激下RA-FLS上MMP-9的分泌

10、水平及酶活性的影響;進(jìn)一步利用利用小RNA干擾RNA(small intefere RNA，siRNA)抑制MMP-9的表達(dá)，以驗證其在介導(dǎo)RA-FLS遷徙與侵襲中的作用。
　　結(jié)果:當(dāng)使用不同濃度的Cel（0.05μM，0.1μM，0.2μM）預(yù)處理RA-FLS24 h，再予1μg/mL的LPS刺激，發(fā)現(xiàn)MMP-1、2、3的表達(dá)無明顯改變，而MMP-9的表達(dá)水平顯著下降;在非細(xì)胞毒濃度范圍內(nèi)，Cel可呈濃度依賴性的抑制LPS誘導(dǎo)

11、的MMP-9 mnRNA的表達(dá)水平。ELISA和明膠酶譜結(jié)果顯示1μg/mL的LPS作用RA-FLS24 h可增加MMP-2及MMP-9的酶活性水平，其中MMP-9增加最為顯著;而當(dāng)使用不同濃度的Cel(0.05μM，0.1μM，0.2μM)預(yù)處理RA-FLS24h，再予1μg/mL的LPS刺激，發(fā)現(xiàn)對MMP-2的酶活性水平無影響，而0.05μM-0.2μM的Cel可顯著下調(diào)MMP-9的酶活性水平。在非細(xì)胞毒濃度范圍內(nèi)，Cel可呈濃度依

12、賴性的抑制LPS誘導(dǎo)的MMP-9酶活性水平。瞬時轉(zhuǎn)染MMP-9 siRNA到RA-FLS后，可顯著抑制1μg/mL的LPS誘導(dǎo)RA-FLS的遷徙與侵襲的細(xì)胞數(shù)量，與siRNA對照組相比，遷徙與侵襲能力下降了約70％。
　　結(jié)論:這些結(jié)果表明，Cel可以選擇性的抑制LPS誘導(dǎo)的MMP-9的基因、蛋白、酶活性水平，并且證實了MMP-9在LPS誘導(dǎo)的RA-FLS遷徙與侵襲中作用。
　　第三部分南蛇藤素抑制TLR4/NF-B通路活化

13、下調(diào)MMP-9轉(zhuǎn)錄的研究
　　目的:為闡明Cel抑制Toll樣受體4(Toll-like receptor4，TLR4)/核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor-κB，NF-κB)信號通路活化進(jìn)而抑制MMP-9轉(zhuǎn)錄的機(jī)制。
　　方法:我們分別構(gòu)建MMP-9啟動子上NF-κB及AP-1位點突變的熒光素酶報告基因質(zhì)粒，予不同濃度的Cel（0.05μM，0.1μM，0.2μM）作用24 h后，利用雙熒光素酶報告基因分析Cel對轉(zhuǎn)

14、錄因子NF-κB及AP-1與MMP-9啟動子結(jié)合活性的影響，證實Cel通過抑制NF-κB與MMP-9啟動子結(jié)合下調(diào)MMP-9轉(zhuǎn)錄活性;凝膠遷移實驗（Electrophoretic mobility shift assay，EMSA）體外研究Cel對NF-κB與MMP-9啟動子NF-κB位點結(jié)合的影響;染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation assay，ChIP)進(jìn)一步體內(nèi)驗證Cel對NF-κB與MM

15、P-9啟動子NF-κB位點結(jié)合的作用;并檢測了不同濃度Cel對TLR4/NF-κB信號通路主要轉(zhuǎn)導(dǎo)分子TLR4、髓樣分化蛋白88(myeloid differentiation primaryresponse gene88，MyD88)、包含TIR域的IFN-β誘導(dǎo)轉(zhuǎn)接蛋白(TIR domaincontaining adaptor inducing interferonβ，TRIF)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB抑制因子(inhibitorof n

16、uclear factor-κB，IκBα)表達(dá)的影響;同時分別加入TLR4通路抑制劑TAK-242及TLR4中和抗體，觀察對MMP-9表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:不同濃度的Cel可以抑制包含AP-1位點突變的MMP-9啟動子的相對熒光素活性，而對包含NF-κB位點突變的MMP-9啟動子的相對熒光素活性無明顯影響。EMSA體外研究發(fā)現(xiàn)LPS刺激RA-FLS后，NF-κB與MMP-9啟動子結(jié)合活性升高，當(dāng)予不同濃度的Cel處理后，再予L

17、PS刺激，NF-κB與MMP-9啟動子結(jié)合活性較前下降;ChIP體內(nèi)研究也證實LPS刺激后，NF-κB與MMP-9啟動子結(jié)合活性升高，而當(dāng)予不同濃度的Cel作用后，NF-κB與MMP-9啟動子結(jié)合活性較前下降。LPS刺激后明顯促進(jìn)了IκBα蛋白磷酸化以及IκBα的降解，并且明顯抑制了LPS誘導(dǎo)的TLR4與MyD88蛋白的表達(dá)上調(diào)，Cel對TRIF的蛋白表達(dá)無顯著影響;qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)TLR4信號通路阻斷劑TAK-242及TLR4中

18、和抗體均可明顯的下調(diào)MMP-9 mRNA、蛋白表達(dá)水平及MMP-9的酶活性水平，并且雙熒光素酶報告基因分析也顯示，抑制TLR4通路或TLR4的表達(dá)，可顯著下調(diào)LPS誘導(dǎo)的MMP-9的轉(zhuǎn)錄活性
　　結(jié)論:這些結(jié)果提示Cel通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路活化，下調(diào)LPS誘導(dǎo)的RA-FLS中MMP-9的表達(dá)。
　　第四部分南蛇藤素抑制CIA大鼠滑膜炎癥及關(guān)節(jié)破壞的研究
　　目的:為從整體水平探討Cel治療類風(fēng)濕

19、關(guān)節(jié)炎的作用與機(jī)制。
　　方法:建立膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠模型，Cel(0.5 mg/kg與1 mg/kg)從第21天開始每天腹腔注射一次，MTX(2 mg/kg從第21天開始每周腹腔注射一次;使用關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index，AI)評估關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度，從初次免疫后20天～40天期間，每3天觀察1次。第42天，使用齒科X-線機(jī)進(jìn)行右后足關(guān)節(jié)拍片評估關(guān)節(jié)破壞

20、程度。然后，處死大鼠，解剖分離右側(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜切片用于組織病理學(xué)分析。滑膜切片H&E染色后對滑膜增殖程度及炎性細(xì)胞浸潤程度進(jìn)行評分。并且，收集各組大鼠血清，采用Westernblot方法檢測MMP-2與MMP-9的活性水平。
　　結(jié)果:我們在造模第18～21天評估造模效果。各藥物治療組較模型對照組軟組織腫脹均有不同程度的改善，高劑量Cel(1 mg/kg)組較低劑量Cel（0.5 mg/kg）組關(guān)節(jié)破壞程度輕，且高劑量Cel治療組以

21、及MTX治療組關(guān)節(jié)間隙正常。不同濃度Cel治療組的AI評分從造模第26天開始與CIA對照組顯著下降，高劑量Cel組AI較低劑量Cel治療組AI下降更為顯著，且高劑量Cel組AI下降與MTX治療組無顯著性差異。與CIA對照組相比，Cel治療組可明顯減輕滑膜增生及炎性細(xì)胞浸潤程度，1 mg/kg的Cel高劑量組較0.5 mg/kg的Cel低劑量組可以更有效的抑制CIA大鼠滑膜增生及炎性細(xì)胞浸潤，高劑量組的療效與MTX(2 mg/kg)組類似