類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)成纖維樣滑膜細(xì)胞蛋白質(zhì)組的研究.pdf

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以慢性關(guān)節(jié)滑膜炎為主要特點(diǎn)的自身免疫性疾病,目前認(rèn)為抗原驅(qū)動(dòng)及T細(xì)胞介導(dǎo)是RA發(fā)病的關(guān)鍵因素,有關(guān)其確切發(fā)病機(jī)制仍未完全明確,因而尚無滿意的診斷方法和治療藥物。近年來蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展,為研究RA的發(fā)病機(jī)制和發(fā)現(xiàn)早期診斷的分子標(biāo)記物提供了科學(xué)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)用二維電泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)和基質(zhì)輔助激光解析

2、電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flightmass spectrometry,MALDI-TOF-MS)分析RA患者與外科創(chuàng)傷患者關(guān)節(jié)成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocyte,FLS)蛋白質(zhì)表達(dá)差異,為尋找RA關(guān)節(jié)滑膜特異性表達(dá)蛋白、RA的早期診斷、藥物靶點(diǎn)篩選及發(fā)病機(jī)制探討提供可靠的實(shí)驗(yàn)研究依據(jù)。
　　

3、 由于健康人滑膜組織難以獲取,本實(shí)驗(yàn)中采用外科創(chuàng)傷患者作為對(duì)照組。取自經(jīng)手術(shù)切除的RA患者和外科創(chuàng)傷患者的滑膜組織,采用膠原酶和胰酶結(jié)合消化法分離培養(yǎng)FLS,免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定FLS內(nèi)波形蛋白(vimentin)的表達(dá)。選用4～7代的FLS,裂解細(xì)胞獲得細(xì)胞總蛋白,Bradford測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,利用2-DE分離RA患者及對(duì)照組FLS總蛋白質(zhì),凝膠經(jīng)銀染顯色和Image Master圖像軟件分析凝膠圖譜,從凝膠中切取差異蛋白質(zhì)斑點(diǎn),MA

4、LDI-TOF-MS分析得到相應(yīng)的肽質(zhì)量指紋圖譜(peptide mass fmgerprinring,PMF),用Mascot查詢軟件搜索數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白,初步分析某些蛋白質(zhì)在FLS中的功能,并對(duì)部分差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行Western blot驗(yàn)證。
　　 光學(xué)顯微鏡下可見,培養(yǎng)的FLS呈梭形或柱形,兩極胞突細(xì)長(zhǎng),末端多與鄰近細(xì)胞連接并交織成網(wǎng)狀,呈現(xiàn)極向排列或渦旋生長(zhǎng)。細(xì)胞核呈卵圓形,位于細(xì)胞中央,核仁明顯。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯

5、示FLS胞漿內(nèi)呈vimentin陽性反應(yīng),陽性細(xì)胞率達(dá)99％以上,符合成纖維細(xì)胞的特征。
　　 RA患者和對(duì)照組FLS的2-DE圖譜分別顯示出1633、1603個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。對(duì)二者相互匹配的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行差異分析,以差異量大于3倍的表達(dá)量為準(zhǔn),初步篩選出92個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn),其中RA中表達(dá)上調(diào)和高豐度表達(dá)的蛋白有33個(gè),下調(diào)表達(dá)的59個(gè)。挑選RA上調(diào)表達(dá)的33個(gè)點(diǎn)進(jìn)行膠內(nèi)原位酶解及MALDI-TOF-MS分析,成功鑒定出30個(gè)

6、點(diǎn),其中有6個(gè)蛋白質(zhì)分子,如葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(78 kDaglucose-regulated protein,BiP)、α-烯醇化酶(α-enolase,NNE)、核纖層蛋白(lamins-A/C,IMN1)、過氧化物還原酶1(peroxiredoxinl,PRDX1)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase,GSTM2)、蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶A3前體(proteindisulfide-isomeras

7、e A3 precursor,ERp60)等己有文獻(xiàn)報(bào)道在RA中呈現(xiàn)特異性表達(dá),其中BiP是RA已知的自身抗原,另有24個(gè)是本研究新發(fā)現(xiàn)的具有潛在應(yīng)用價(jià)值的分子標(biāo)記物。根據(jù)數(shù)據(jù)庫提供的信息,對(duì)鑒定的蛋白質(zhì)按功能進(jìn)行初步分類,主要涉及:①參與物質(zhì)代謝或能量產(chǎn)生的生物酶類,如腫瘤型丙酮酸激酶(M2-pyruvatekinase,M2-PK),α-enolase;②細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白,如膜聯(lián)蛋白(annexin A11,ANX11);③細(xì)胞結(jié)構(gòu)

8、蛋白,如lamin-A/C,核基質(zhì)蛋白(ruvB-like1,NMP238);④分子伴侶,如葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(stress-70 protein,mitochonddal precursor,GRP75),αB-晶體蛋白(α-crystallin B chain,HspB5);⑤假定或未知蛋白,如PSME4,SELENBP1。
　　 為進(jìn)一步證實(shí)差異蛋白在RA中的特異表達(dá),我們選擇4個(gè)差異蛋白α-enolase、lamin—A/C