濾泡輔助性T細(xì)胞在口蹄疫重組腺病毒疫苗免疫應(yīng)答中的作用研究.pdf

1、目的:濾泡輔助性T細(xì)胞(FollicularTHelpercells,Tfh細(xì)胞)是一類全新的T細(xì)胞亞群,Tfh細(xì)胞在B細(xì)胞的發(fā)育、生發(fā)中心的形成、抗體類別轉(zhuǎn)換,建立長(zhǎng)期體液免疫應(yīng)答等過程中扮演主要角色。本研究利用表達(dá)口蹄疫病毒VP1基因的重組腺病毒疫苗(rAd5VP1)免疫小鼠,通過觀察小鼠脾臟中濾泡輔助性T細(xì)胞(Tfollicularhelpercells,Tfh)的分化、生發(fā)中心(GC)的形成、Tfh細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子BCL-6mRNA

2、的表示水平及Tfh細(xì)胞主要細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-21(interleukin-21,IL-21)的分泌水平,探討Tfh細(xì)胞在口蹄疫重組腺病毒疫苗免疫應(yīng)答中所發(fā)揮的作用。
　　方法:6周齡BALB/c小鼠,隨機(jī)分為兩組,每組10只。實(shí)驗(yàn)組免疫rAd5VP1,對(duì)照組注射PBS。
　　1.免疫后7d,取小鼠脾臟,分離單個(gè)核細(xì)胞,通過流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)Tfh細(xì)胞(CD4+CXCR5+PD-1+)的分化、生發(fā)中心B細(xì)胞(B220+

3、GL-7+)的分化;分析CXCR5+T細(xì)胞/CD4+T細(xì)胞的比例、CXCR5+PD-1+T細(xì)胞/CD4+T細(xì)胞的比例、GL-7+B細(xì)胞/B220+B細(xì)胞的比例。
　　2.免疫后7d,取小鼠脾臟,分離單個(gè)核細(xì)胞,通過real-timeRT-PCR技術(shù)檢測(cè)Tfh細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子BCL-6mRNA的表達(dá)水平。
　　3.免疫后7d,取小鼠脾臟,常規(guī)方法制作石蠟切片,經(jīng)FITC-花生凝集素(PeanutAgglutinin,PNA)染色,

4、免疫熒光顯微鏡觀察生發(fā)中心的形成。
　　4.免疫后7d,分離血清,采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒檢測(cè)小鼠血清中Tfh細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-21的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.重組腺病毒疫苗rAd5VP1免疫小鼠,7d后,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,重組腺病毒疫苗rAd5VP1能誘導(dǎo)小鼠Tfh細(xì)胞的分化,而且,單個(gè)核細(xì)胞中CXCR5+T細(xì)胞/CD4+T細(xì)胞的比例(4.05±0.10)明顯高于PBS對(duì)照組(2.14

5、±0.29),P=0.007.**P<0.01;單個(gè)核細(xì)胞中CXCR5+PD-1+T細(xì)胞/CD4+T細(xì)胞的比例(1.17±0.17)明顯高于PBS對(duì)照組(0.69±0.17),P=0.03.*P<0.05;
　　2.重組腺病毒疫苗rAd5VP1免疫小鼠,7d后,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,單個(gè)核細(xì)胞中GL-7+B細(xì)胞/B220+B細(xì)胞的比例(3.66±0.53)明顯高于PBS對(duì)照組(1.74±0.05),P=0.02.*P<0.05;

6、
　　3.重組腺病毒疫苗rAd5VP1免疫小鼠,7d后,real-timeRT-PCR檢測(cè)BCL-6mRNA的相對(duì)表達(dá)水平得到CT值,進(jìn)行相對(duì)定量處理得到2–ΔΔCT值,再行統(tǒng)計(jì)分析得到疫苗rAd5VP1免疫組中BCL-6mRNA表達(dá)量是對(duì)照組表達(dá)量的2.39倍。P=0.001.**P<0.01。
　　4.重組腺病毒疫苗rAd5VP1免疫小鼠,7d后,分離血清,ELISA試劑盒檢測(cè)血清中IL-21分泌水平,結(jié)果顯示,rAd5

7、VP1實(shí)驗(yàn)組中IL-21表達(dá)量(63.68±13.15,pg/ml)明顯高于PBS對(duì)照組表達(dá)量(4.65±2.36,pg/ml),P=0.02.*P<0.05。
　　5.重組腺病毒疫苗rAd5VP1免疫小鼠,7d后,常規(guī)方法制作石蠟切片,經(jīng)FITC-PNA染色,免疫熒光顯微鏡觀察生發(fā)中心的形成。結(jié)果顯示,重組腺病毒疫苗rAd5VP1能誘導(dǎo)生發(fā)中心的形成,經(jīng)ImageJ軟件分析平均熒光密度數(shù)值,統(tǒng)計(jì)得出,rAd5VP1組表達(dá)量(12

8、.54±1.77)明顯高于PBS對(duì)照組表達(dá)量PBS(6.71±0.55),P=0.00001.**P<0.01。
　　結(jié)論:利用口蹄疫重組腺病毒疫苗rAd5VP1免疫小鼠,7d后,重組腺病毒疫苗能誘導(dǎo)Tfh細(xì)胞的分化、促進(jìn)GC的形成及促進(jìn)GCB細(xì)胞的分化、提高Tfh細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子BCL-6mRNA的表示水平,及增強(qiáng)Tfh細(xì)胞主要細(xì)胞因子IL-21的分泌水平。結(jié)果顯示,在口蹄疫重組腺病毒疫苗誘導(dǎo)小鼠免疫應(yīng)答中,Tfh細(xì)胞及其效應(yīng)分子都