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1、該課題對血管內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制因子(VEGI)的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系及作用機(jī)制進(jìn)行了研究.第一部分:EVGI結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究1.首先將VEGI與TNF超家族其他成員TNFα、TNFβ、CD40L及TRAIL進(jìn)行了基于結(jié)構(gòu)知識的一級結(jié)構(gòu)序列聯(lián)配,比較分析了TNF超家族其他成員蛋白中結(jié)構(gòu)與功能關(guān)鍵殘基的分布,在此基礎(chǔ)上分析推導(dǎo)出VEGI蛋白結(jié)構(gòu)特異殘基的分布.2.根據(jù)TNF超家族其他成員TNFα、TNFβ、CD40L及TRAIL的晶體結(jié)構(gòu),采用同
2、源蛋白模建了VEGI蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu).結(jié)果顯示:VEGI預(yù)測結(jié)構(gòu)的骨架與TNFα晶體結(jié)構(gòu)極為相似,也是由3個呈β-Jellyroll拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的亞基組成的鐘形結(jié)構(gòu).3.為研究蛋白質(zhì)N端對活性的影響,構(gòu)建了N端缺失43與51個氨基酸的VEGI表達(dá)載體并在大腸桿菌中表達(dá)及純化,采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖和雞胚尿囊膜血管生成實驗研究了兩個缺失突變體的活性.結(jié)果表明:N端缺失43個氨基酸的VEGI突變體具有與野生型VEGI相似的作用,而N端缺失51
3、個氨基酸可使VEGI活性明顯降低.4.為研究VEGI空中樓間結(jié)構(gòu)上的重要?dú)埢淖饔脴O其對生物活性的影響,采用定點(diǎn)突變技術(shù)突變了四個關(guān)鍵氨基酸E<'45>R,G<'47>A,Y<'111>F,Y<'111>T,構(gòu)建了表達(dá)載體并在大腸肝菌中形式表達(dá)及純化,采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖和雞胚尿囊膜血管生成實驗研究了四個突變體的活性.結(jié)果表明:E<'45>R突變體的活性顯著下降,G<'47>A突變體的活性略低于野生型VEGI,Y<'111>F,Y<
4、'111>T突變體的自學(xué)成才性比野生型VEGI下降十倍以上.第二部分:VEGI生物活性與作用機(jī)制研究1.以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)為研究對象研究了VEGI對其增殖,遷移,白細(xì)胞粘附等體外生物活性的影響,結(jié)果表明:VEGI可劑量依賴地抑制HUVEC的增殖與遷移卻促進(jìn)中性粒細(xì)胞附于HUVEC.2.采用RT-PCR,Western blot等方法研究了VEGI對VEGF與ICAM-1在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的影響.3.采用明膠酶譜方法研究了VE
5、GI對MMP-2表達(dá)的影響,結(jié)果表明:VEGI蛋白可顯著下調(diào)MMP-2激活形式的表達(dá)并呈劑量依賴的抑制作用.4.采用分光光度法研究了VEGI對NO產(chǎn)生的影響,結(jié)果表明:VEGI可劑量依賴地抑制HUVEC細(xì)胞產(chǎn)生NO.5.研究了VEGI對內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞周期的影響,結(jié)果顯示:VEGI可劑依賴地誘導(dǎo)HUVEC生長停滯于G<,0>-G<,I>期,抑制其進(jìn)入S期.6.建立了裸鼠異種移植人肝癌SMMC7721的腫瘤模型,采用此模型研究了VEGI對人肝
6、癌的影響,結(jié)果顯示:VEGI顯著抑制人肝癌SMMC7721的生長,且其作用并非是直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖而是部分通過抑制VEGF表達(dá)實現(xiàn)的.7.制作囝VEGI多克隆抗體.初步純化的抗體滴度達(dá)到期:10560,此抗體可中和重組VEGI蛋白抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖與血管生成活性.進(jìn)一步表明:VEGI是血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性抑制因子.結(jié)論:我們的研究首次發(fā)現(xiàn):VEGI三維結(jié)構(gòu)是由3個呈β-Jellyroll拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的亞基組成的鐘形結(jié)構(gòu);VEGI的第44-5
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