基于hTERT腫瘤靶向性的酪氨酸酶報告基因MRI分子成像的實驗研究.pdf

1、一、研究目的和意義
　　 惡性腫瘤是人類死亡的主要原因之一。腫瘤的早期診斷和治療是腫瘤患者獲得長期生存的主要途徑。目前對實體瘤的診斷臨床上主要是依靠影像學(xué)的方法，但傳統(tǒng)的CT、MRI和X線成像均是建立在疾病解剖結(jié)構(gòu)異常的基礎(chǔ)之上，往往是在疾病的終未階段。由于存在“同病異影，異病同影”，導(dǎo)致一些非典型(如肺部孤立結(jié)節(jié))或少見、早期實體瘤的定性診斷困難；PET/CT被認(rèn)為是目前對實體瘤進(jìn)行早期定性定位診斷最佳的檢查方法，但臨床常用的

2、PET檢查示蹤劑18F-FDG是針對病變對葡萄糖攝取率的高低來間接判斷其良惡性，而并非腫瘤特異性示蹤劑，存在假陽性和假陰性；活檢是腫瘤定性診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但某些特殊部位的病變(如心臟、大血管周圍)，活檢取材風(fēng)險較大，且能夠活檢的腫瘤通常已是中晚期，患者往往已喪失最佳的治療時間。因此，急需探索一種無創(chuàng)、有效的在疾病的分子水平進(jìn)行早期定性診斷的新方法。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展以及分子探針在影像學(xué)中的不斷應(yīng)用，影像醫(yī)學(xué)已從對傳統(tǒng)的解剖和生理功能的研

3、究深入到分子水平成像，尤其是近年快速發(fā)展的MR分子成像技術(shù)為腫瘤的早期定性診斷提供了新思路。
　　 以MR報告基因表達(dá)成像為顯像模式的MR分子影像學(xué)是目前的研究熱點。所謂MR報告基因，即基因所表達(dá)的產(chǎn)物或其與攜帶影像標(biāo)記物的分子探針特異性結(jié)合，從而引起影像信號改變的基因。酪氨酸酶基因(tyrosinase，Tyr)作為MR報告基因已引起眾多學(xué)者的關(guān)注，成為目前的研究熱點。酪氨酸酶基因表達(dá)生成酪氨酸酶，酪氨酸酶是黑色素細(xì)胞生成的限

4、速酶，它通過催化多種反應(yīng)可在各類非黑色素細(xì)胞中生成黑色素。而黑色素的一個顯著特點是帶有大量陰離子，對各種金屬陽離子具有高親和力(可達(dá)自身重量的35％)，可吸附細(xì)胞外液和細(xì)胞內(nèi)的金屬離子，尤其是Fe3+。據(jù)測算平均每克黑色素就有多達(dá)1020個Fe3+吸附位點。Fe3+是一種順磁性物質(zhì)(類似于Gd3+對比劑)，MR信號的變化與Fe3+的濃度密切相關(guān)。在一定的濃度范圍內(nèi)，以顯著縮短周圍組織氫質(zhì)子的縱向馳豫時間(T1)為主，靶組織表現(xiàn)為MR T

5、1特征性高信號，且信號增高與Fe3+聚集的量成線性相關(guān)。Fe3+是人體生命活動所必須的金屬元素，人體就是一個巨大的鐵庫。酪氨酸酶基因作為MR分子成像的報告基因，是以內(nèi)源性Fe3+為成像的基礎(chǔ)，成像過程中避免了外源性示蹤劑(如SPIO)會隨著細(xì)胞的分裂分化信號逐漸丟失的缺點，也不需要分子探針作用于底物，因此是一種較為理想的MR成像基因。由于MR T1WI信號主要是由黑色素形成的量決定的，平均信號強(qiáng)度與酪氨酸活性和黑色素之間存在極顯著的相關(guān)

6、性，因此可通過測量MR T1WI的信號強(qiáng)度來反應(yīng)酪氨酸酶基因在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平，同時可間接反映標(biāo)記基因的活性，兩者之間存在明顯的線性關(guān)系。因而黑色素可成為MR的分子探針。
　　 如何使酪氨酸酶基因僅在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)而不在其他正常組織或細(xì)胞中表達(dá)，是實現(xiàn)腫瘤特異性診斷的關(guān)鍵。目前已知的腫瘤特異性抗原啟動子特異性太強(qiáng)，如AFP啟動子只在肝癌細(xì)胞中表達(dá)、CEA啟動子只在部分消化道腫瘤或肺癌中表達(dá)、PSA啟動子只在前列腺癌中表達(dá)，如

7、果用這些啟動子來啟動下游酪氨酸酶基因表達(dá)，只適用于具有該抗原的惡性腫瘤，診斷窗口較窄。因此需要尋找一種廣譜的腫瘤特異性抗原啟動子，在該啟動子的作用下，其下游的報告基因只在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，而在正常細(xì)胞中不表達(dá)。
　　 端粒酶作為腫瘤無限增殖的必要條件，在絕大部分惡性腫瘤中表達(dá)，而在正常體細(xì)胞中，除少數(shù)增生旺盛的細(xì)胞及干細(xì)胞有少量表達(dá)外，其余均為陰性。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)作為端粒酶的限速酶，在端粒酶的活性調(diào)控中具有重要作用

8、。我們過去的研究表明hTERT只在惡性腫瘤及部分癌前組織中表達(dá)，而正常組織細(xì)胞中不表達(dá)，針對hTERT的腫瘤免疫基因治療只殺傷hTERT陽性的腫瘤細(xì)胞，而對正常體細(xì)胞、尤其是低表達(dá)hTERT的淋巴細(xì)胞不具有殺傷活性。由此可見，端粒酶的活性是通過hTERT基因的轉(zhuǎn)錄機(jī)制而嚴(yán)格調(diào)控的，而hTERT基因的轉(zhuǎn)錄又受hTERT啟動子的調(diào)控。由于端粒酶在85%以上的惡性腫瘤細(xì)胞或組織中表達(dá)，因此，hTERT啟動子具有良好的腫瘤靶向性，可以作為一種腫

9、瘤特異性啟動子用于腫瘤的靶向性診斷及治療。
　　 基于以上分析，本課題擬以hTERT啟動子作為腫瘤靶向性啟動子，驅(qū)動MR報告基因－－酪氨酸酶基因的表達(dá)，研究基于hTERT啟動子驅(qū)動酪氨酸酶報告基因的表達(dá)在MR診斷惡性腫瘤中的價值，為MR在占位性病變定性診斷中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 本課題組在上一個國家自然科學(xué)基金項目(No：30871150)的資助下，已經(jīng)設(shè)計并成功構(gòu)建了hTERT優(yōu)化型啟動子的治療性慢病毒載體pLe

10、nti-hTERTp/CD-IRES2-EGFP和pLenti-CMVp/CD-IRES2-EGFP。體內(nèi)外研究表明，該優(yōu)化型hTERT啟動子驅(qū)動的自殺基因CD只殺傷端粒酶陽性的腫瘤細(xì)胞，而對端粒酶陰性的腫瘤細(xì)胞不起作用，說明我們設(shè)計并構(gòu)建的hTERT啟動子具有明顯的端粒酶靶向性。
　　 綜上所述，本項目擬在前期相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，以hTERT作為酪氨酸酶基因的啟動子，利用hTERT啟動子的端粒酶特異性，使酪氨酸酶基因只在端粒酶陽

11、性的惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)生成黑色素，吸附細(xì)胞外液和細(xì)胞內(nèi)的Fe3+，然后借助高分辨率的MRI檢測技術(shù)實現(xiàn)腫瘤的早期診斷。期望通過上述研究，為基于hTERT啟動子的酪氨酸酶報告基因的表達(dá)在MR占位性病變中的定性診斷提供理論依據(jù)。
　　 二、研究方法
　　 1.分別構(gòu)建基于端粒酶特異性hTERT啟動子和非特異性CMV啟動子的含有MR報告基因(Tyr基因)和EGFP綠色熒光蛋白的雙報告基因系統(tǒng)的慢病毒表達(dá)載體(pLenti-hT

12、ERT/Tyr-IRES2-EGFP與pLenti-CMV/Tyr-IRES2-EGFP)
　　 首先從公司購買含有MR報告基因酪氨酸酶基因(Tyrosinase)全長編碼基因的Hum-ORF-M13，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5-α細(xì)菌及擴(kuò)增抽提，采用PCR擴(kuò)增Tyrosinase基因全長cDNA，與T載體連接后獲得pMD19-Tyr質(zhì)粒，酶切該質(zhì)粒即可得到Tyr片段；用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切我們將前期已經(jīng)成功構(gòu)建的hTERT/CD-

13、IRES2-EGFP和CMV/CD-IRES2-EGFP質(zhì)粒，得到線性hTERTp-EGFP片段和線性CMVp-EGFP片段；用T4 DNA連接酶將Tyr片段分別與線性hTERTp-EGFP片段和線性CMVp-EGFP片段連接，即可得到本實驗所需要的hTERT/Tyr-IRES2-EGFP和CMVp/Tyr-IRES2-EGFP質(zhì)粒。采用酶切鑒定和測序鑒定驗證我們所構(gòu)建質(zhì)粒的正確性。采用四質(zhì)粒包裝系統(tǒng)包裝并濃縮病毒，測定病毒滴度和最佳感

14、染MOI。
　　 2.慢病毒表達(dá)載體端粒酶靶向性檢測以及MR成像的體外研究
　　 pLenti-hTERT/Tyr-IRES2-EGFP與pLenti-CMV/Tyr-IRES2-EGFP慢病毒分別體外感染端粒酶陽性HepG2、SGC7901、SW480細(xì)胞和端粒酶陰性U2OS細(xì)胞，共8株細(xì)胞，加上未感染病毒的對應(yīng)的4株細(xì)胞，共12株細(xì)胞設(shè)定為靶細(xì)胞，其中CMV啟動子感染的細(xì)胞為陽性對照組，hTERT啟動子感染的端粒酶陰

15、性細(xì)胞U2OS以及未感染的細(xì)胞為陰性對照組，hTERT啟動子感染端粒酶陽性細(xì)胞為目標(biāo)實驗組。采用激光共聚焦觀察各靶細(xì)胞EGFP的表達(dá)；采用RT-PCR檢測各靶細(xì)胞中酪氨酸酶mRNA表達(dá)情況；采用WB檢測各靶細(xì)胞中酪氨酸酶蛋白的表達(dá)情況；采用比色法檢測各靶細(xì)胞490nm處吸光度值，測定各細(xì)胞的酪氨酸酶活性；采用Fontana染色檢測各靶細(xì)胞中黑色素顆粒生成的情況；采用普魯士藍(lán)染色檢測各靶細(xì)胞與鐵離子按不同時間點共同孵育后，鐵離子吸附情況隨

16、時間點變化而變化的情況；采用MR掃描檢測各靶細(xì)胞與鐵離子按不同時間點共同孵育后對細(xì)胞MR信號變化的影響。
　　 3.慢病毒表達(dá)載體對腫瘤MR特異性診斷的體內(nèi)研究
　　 將分別感染了兩種慢病毒的SGC7901和U2OS細(xì)胞接種于SCID小鼠右側(cè)皮下，未感染慢病毒的對應(yīng)細(xì)胞對稱接種在SCID小鼠左側(cè)皮下，制成荷瘤小鼠模型。采用3.0TMR掃描儀對小鼠進(jìn)行掃描，觀察CMV啟動子和hTERT啟動子腫瘤MR信號的變化；觀察端粒酶陽

17、性腫瘤和陰性腫瘤MR信號的變化；觀察感染細(xì)胞和未感染細(xì)胞MR信號的變化，研究在hTERT啟動子驅(qū)動下，MR報告基因酪氨酸酶基因?qū)Χ肆Ｃ戈栃阅[瘤MR定性診斷的可行性。并利用小動物熒光成像儀觀察所有小鼠兩側(cè)腫瘤在體或離體下綠色熒光蛋白的表達(dá)情況；同時將腫瘤標(biāo)本進(jìn)行Fontana染色和普魯士藍(lán)染色，觀察各腫瘤細(xì)胞內(nèi)部黑色素顆粒的生成情況以及鐵離子的吸附情況。
　　 三、結(jié)果
　　 1.pLenti-hTERT/Tyr-IRES

18、2-EGFP與pLenti-CMV/Tyr-IRES2-EGFP慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及其包裝
　　 酶切鑒定證實我們所構(gòu)建的質(zhì)粒中含有大小為1600bp的條帶，與MR報告基因酪氨酸酶基因的理論大小相吻合；測序結(jié)果經(jīng)與GENE BANK數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，也證實構(gòu)建的質(zhì)粒中含有酪氨酸酶全長cDNA。提示已成功構(gòu)建了hTERT/Tyr-IRES2-EGFP與CMV/Tyr-IRES2-EGFP質(zhì)粒；經(jīng)慢病毒4質(zhì)粒系統(tǒng)包裝后，檢測其滴度達(dá)

19、108數(shù)量級。
　　 2.慢病毒表達(dá)載體端粒酶靶向性檢測以及MR成像的體外研究
　　 激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示在端粒酶陽性的腫瘤細(xì)胞中(SGC-7901胃癌細(xì)胞、HepG2肝癌細(xì)胞、SW480結(jié)腸癌細(xì)胞)，CMV和hTERT啟動子慢病毒感染后均有EGFP的表達(dá)，而端粒酶陰性的U2OS骨肉瘤細(xì)胞只有CMV啟動子慢病毒感染后有EGFP表達(dá)，hTERT啟動子慢病毒感染后則沒有EGFP的表達(dá)；RT-PCR和WB結(jié)果顯示端粒酶陽性

20、的上述細(xì)胞CMV和hTERT啟動子病毒感染后均具有酪氨酸酶mRNA和蛋白的表達(dá)，而端粒酶陰性的細(xì)胞只有CMV啟動子感染后的有酪氨酸酶mRNA和蛋白的表達(dá)，hTERT啟動子病毒感染后則沒有酪氨酸酶mRNA和蛋白的表達(dá)；A490結(jié)果顯示端粒酶陽性的上述細(xì)胞CMV和hTERT啟動子病毒感染后以及端粒酶陰性細(xì)胞CMV啟動子感染后，細(xì)胞具有較強(qiáng)的酪氨酸酶活性，且顯著高于端粒酶陰性細(xì)胞hTERT啟動子病毒感染后的細(xì)胞以及未感染的細(xì)胞(p<0.01)

21、；Fontana染色結(jié)果表明，具有酪氨酸酶活性的各株細(xì)胞胞漿內(nèi)可見棕褐色銀沉著顆粒，而沒有酪氨酸酶活性的細(xì)胞內(nèi)則缺乏此棕褐色顆粒；普魯士藍(lán)結(jié)果顯示經(jīng)與鐵離子按不同時間點共同孵育后，具有酪氨酸酶活性的細(xì)胞內(nèi)隨著孵育時間的延長，細(xì)胞內(nèi)可見大量藍(lán)染的鐵顆粒沉著，在36h-48h以后達(dá)到峰值，而沒有酪氨酸酶活性的細(xì)胞內(nèi)則僅見少量藍(lán)染鐵顆粒沉著，且隨著時間的延長，沉著的鐵顆粒未見明顯增加；MR掃描結(jié)果顯示，具有酪氨酸酶活性的細(xì)胞團(tuán)其T1WI信號強(qiáng)

22、度隨著與鐵離子孵育時間的延長而明顯增加，且顯著高于沒有酪氨酸酶活性的細(xì)胞團(tuán)(p<0.01)。
　　 3.慢病毒表達(dá)載體對不同腫瘤細(xì)胞MR分子影像診斷的體內(nèi)研究
　　 體內(nèi)試驗結(jié)果顯示SICD小鼠右側(cè)感染CMV啟動子慢病毒的端粒酶陽性腫瘤細(xì)胞SGC7901和端粒酶陰性腫瘤細(xì)胞U2OS在MR掃描T1WI像上信號強(qiáng)度明顯高于左側(cè)未感染病毒的SGC7901和U2OS細(xì)胞(p<0.05)；SCID小鼠右側(cè)感染hTERT啟動子病毒的

23、端粒酶陰性腫瘤細(xì)胞U2OS在MR掃描T1WI像上信號強(qiáng)度與小鼠左側(cè)未感染病毒的U2OS腫瘤細(xì)胞信號強(qiáng)度相似(p>0.05)，而小鼠右側(cè)感染hTERT啟動子的端粒酶陽性腫瘤細(xì)胞SGC7901在MR掃描T1WI像上信號強(qiáng)度明顯高于左側(cè)未感染病毒的SGC7901(p<0.05)；小動物熒光成像結(jié)果顯示MR掃描信號增高的腫瘤均可見綠色熒光，MR掃描信號未增加的腫瘤則未見綠色熒光；Fontana染色結(jié)果顯示所有MR信號增高的腫瘤標(biāo)本中均有大量黑色

24、顆粒沉著，提示有黑色素小體生成，而信號未增高的腫瘤標(biāo)本中則未見黑色顆粒沉著；普魯士藍(lán)染色結(jié)果顯示MR信號增高的腫瘤標(biāo)本內(nèi)部可見大量藍(lán)染鐵顆粒，而信號未增高的腫瘤標(biāo)本中則僅見少量散在的藍(lán)染鐵顆粒沉著。
　　 四、結(jié)論
　　 1.在前期研究基礎(chǔ)之上，成功改構(gòu)了基于hTERT啟動子的含有MR報告基因(酪氨酸酶基因)的端粒酶陽性腫瘤特異性診斷的慢病毒表達(dá)載體，體內(nèi)外實驗證實該病毒同樣具有嚴(yán)格的端粒酶靶向性。
　　 2.該