基于hTERT腫瘤靶向性的酪氨酸酶報(bào)告基因MRI分子成像的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一、研究目的和意義
　　 惡性腫瘤是人類(lèi)死亡的主要原因之一。腫瘤的早期診斷和治療是腫瘤患者獲得長(zhǎng)期生存的主要途徑。目前對(duì)實(shí)體瘤的診斷臨床上主要是依靠影像學(xué)的方法，但傳統(tǒng)的CT、MRI和X線(xiàn)成像均是建立在疾病解剖結(jié)構(gòu)異常的基礎(chǔ)之上，往往是在疾病的終未階段。由于存在“同病異影，異病同影”，導(dǎo)致一些非典型(如肺部孤立結(jié)節(jié))或少見(jiàn)、早期實(shí)體瘤的定性診斷困難；PET/CT被認(rèn)為是目前對(duì)實(shí)體瘤進(jìn)行早期定性定位診斷最佳的檢查方法，但臨床常用的

2、PET檢查示蹤劑18F-FDG是針對(duì)病變對(duì)葡萄糖攝取率的高低來(lái)間接判斷其良惡性，而并非腫瘤特異性示蹤劑，存在假陽(yáng)性和假陰性；活檢是腫瘤定性診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但某些特殊部位的病變(如心臟、大血管周?chē)?，活檢取材風(fēng)險(xiǎn)較大，且能夠活檢的腫瘤通常已是中晚期，患者往往已喪失最佳的治療時(shí)間。因此，急需探索一種無(wú)創(chuàng)、有效的在疾病的分子水平進(jìn)行早期定性診斷的新方法。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展以及分子探針在影像學(xué)中的不斷應(yīng)用，影像醫(yī)學(xué)已從對(duì)傳統(tǒng)的解剖和生理功能的研

3、究深入到分子水平成像，尤其是近年快速發(fā)展的MR分子成像技術(shù)為腫瘤的早期定性診斷提供了新思路。
　　 以MR報(bào)告基因表達(dá)成像為顯像模式的MR分子影像學(xué)是目前的研究熱點(diǎn)。所謂MR報(bào)告基因，即基因所表達(dá)的產(chǎn)物或其與攜帶影像標(biāo)記物的分子探針特異性結(jié)合，從而引起影像信號(hào)改變的基因。酪氨酸酶基因(tyrosinase，Tyr)作為MR報(bào)告基因已引起眾多學(xué)者的關(guān)注，成為目前的研究熱點(diǎn)。酪氨酸酶基因表達(dá)生成酪氨酸酶，酪氨酸酶是黑色素細(xì)胞生成的限

4、速酶，它通過(guò)催化多種反應(yīng)可在各類(lèi)非黑色素細(xì)胞中生成黑色素。而黑色素的一個(gè)顯著特點(diǎn)是帶有大量陰離子，對(duì)各種金屬陽(yáng)離子具有高親和力(可達(dá)自身重量的35％)，可吸附細(xì)胞外液和細(xì)胞內(nèi)的金屬離子，尤其是Fe3+。據(jù)測(cè)算平均每克黑色素就有多達(dá)1020個(gè)Fe3+吸附位點(diǎn)。Fe3+是一種順磁性物質(zhì)(類(lèi)似于Gd3+對(duì)比劑)，MR信號(hào)的變化與Fe3+的濃度密切相關(guān)。在一定的濃度范圍內(nèi)，以顯著縮短周?chē)M織氫質(zhì)子的縱向馳豫時(shí)間(T1)為主，靶組織表現(xiàn)為MR T

5、1特征性高信號(hào)，且信號(hào)增高與Fe3+聚集的量成線(xiàn)性相關(guān)。Fe3+是人體生命活動(dòng)所必須的金屬元素，人體就是一個(gè)巨大的鐵庫(kù)。酪氨酸酶基因作為MR分子成像的報(bào)告基因，是以?xún)?nèi)源性Fe3+為成像的基礎(chǔ)，成像過(guò)程中避免了外源性示蹤劑(如SPIO)會(huì)隨著細(xì)胞的分裂分化信號(hào)逐漸丟失的缺點(diǎn)，也不需要分子探針作用于底物，因此是一種較為理想的MR成像基因。由于MR T1WI信號(hào)主要是由黑色素形成的量決定的，平均信號(hào)強(qiáng)度與酪氨酸活性和黑色素之間存在極顯著的相關(guān)

6、性，因此可通過(guò)測(cè)量MR T1WI的信號(hào)強(qiáng)度來(lái)反應(yīng)酪氨酸酶基因在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平，同時(shí)可間接反映標(biāo)記基因的活性，兩者之間存在明顯的線(xiàn)性關(guān)系。因而黑色素可成為MR的分子探針。
　　 如何使酪氨酸酶基因僅在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)而不在其他正常組織或細(xì)胞中表達(dá)，是實(shí)現(xiàn)腫瘤特異性診斷的關(guān)鍵。目前已知的腫瘤特異性抗原啟動(dòng)子特異性太強(qiáng)，如AFP啟動(dòng)子只在肝癌細(xì)胞中表達(dá)、CEA啟動(dòng)子只在部分消化道腫瘤或肺癌中表達(dá)、PSA啟動(dòng)子只在前列腺癌中表達(dá)，如

7、果用這些啟動(dòng)子來(lái)啟動(dòng)下游酪氨酸酶基因表達(dá)，只適用于具有該抗原的惡性腫瘤，診斷窗口較窄。因此需要尋找一種廣譜的腫瘤特異性抗原啟動(dòng)子，在該啟動(dòng)子的作用下，其下游的報(bào)告基因只在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，而在正常細(xì)胞中不表達(dá)。
　　 端粒酶作為腫瘤無(wú)限增殖的必要條件，在絕大部分惡性腫瘤中表達(dá)，而在正常體細(xì)胞中，除少數(shù)增生旺盛的細(xì)胞及干細(xì)胞有少量表達(dá)外，其余均為陰性。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)作為端粒酶的限速酶，在端粒酶的活性調(diào)控中具有重要作用

8、。我們過(guò)去的研究表明hTERT只在惡性腫瘤及部分癌前組織中表達(dá)，而正常組織細(xì)胞中不表達(dá)，針對(duì)hTERT的腫瘤免疫基因治療只殺傷hTERT陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞，而對(duì)正常體細(xì)胞、尤其是低表達(dá)hTERT的淋巴細(xì)胞不具有殺傷活性。由此可見(jiàn)，端粒酶的活性是通過(guò)hTERT基因的轉(zhuǎn)錄機(jī)制而嚴(yán)格調(diào)控的，而hTERT基因的轉(zhuǎn)錄又受hTERT啟動(dòng)子的調(diào)控。由于端粒酶在85%以上的惡性腫瘤細(xì)胞或組織中表達(dá)，因此，hTERT啟動(dòng)子具有良好的腫瘤靶向性，可以作為一種腫

9、瘤特異性啟動(dòng)子用于腫瘤的靶向性診斷及治療。
　　 基于以上分析，本課題擬以hTERT啟動(dòng)子作為腫瘤靶向性啟動(dòng)子，驅(qū)動(dòng)MR報(bào)告基因－－酪氨酸酶基因的表達(dá)，研究基于hTERT啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)酪氨酸酶報(bào)告基因的表達(dá)在MR診斷惡性腫瘤中的價(jià)值，為MR在占位性病變定性診斷中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 本課題組在上一個(gè)國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No：30871150)的資助下，已經(jīng)設(shè)計(jì)并成功構(gòu)建了hTERT優(yōu)化型啟動(dòng)子的治療性慢病毒載體pLe

10、nti-hTERTp/CD-IRES2-EGFP和pLenti-CMVp/CD-IRES2-EGFP。體內(nèi)外研究表明，該優(yōu)化型hTERT啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的自殺基因CD只殺傷端粒酶陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞，而對(duì)端粒酶陰性的腫瘤細(xì)胞不起作用，說(shuō)明我們?cè)O(shè)計(jì)并構(gòu)建的hTERT啟動(dòng)子具有明顯的端粒酶靶向性。
　　 綜上所述，本項(xiàng)目擬在前期相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，以hTERT作為酪氨酸酶基因的啟動(dòng)子，利用hTERT啟動(dòng)子的端粒酶特異性，使酪氨酸酶基因只在端粒酶陽(yáng)

11、性的惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)生成黑色素，吸附細(xì)胞外液和細(xì)胞內(nèi)的Fe3+，然后借助高分辨率的MRI檢測(cè)技術(shù)實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期診斷。期望通過(guò)上述研究，為基于hTERT啟動(dòng)子的酪氨酸酶報(bào)告基因的表達(dá)在MR占位性病變中的定性診斷提供理論依據(jù)。
　　 二、研究方法
　　 1.分別構(gòu)建基于端粒酶特異性hTERT啟動(dòng)子和非特異性CMV啟動(dòng)子的含有MR報(bào)告基因(Tyr基因)和EGFP綠色熒光蛋白的雙報(bào)告基因系統(tǒng)的慢病毒表達(dá)載體(pLenti-hT

12、ERT/Tyr-IRES2-EGFP與pLenti-CMV/Tyr-IRES2-EGFP)
　　 首先從公司購(gòu)買(mǎi)含有MR報(bào)告基因酪氨酸酶基因(Tyrosinase)全長(zhǎng)編碼基因的Hum-ORF-M13，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5-α細(xì)菌及擴(kuò)增抽提，采用PCR擴(kuò)增Tyrosinase基因全長(zhǎng)cDNA，與T載體連接后獲得pMD19-Tyr質(zhì)粒，酶切該質(zhì)粒即可得到Tyr片段；用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切我們將前期已經(jīng)成功構(gòu)建的hTERT/CD-

13、IRES2-EGFP和CMV/CD-IRES2-EGFP質(zhì)粒，得到線(xiàn)性hTERTp-EGFP片段和線(xiàn)性CMVp-EGFP片段；用T4 DNA連接酶將Tyr片段分別與線(xiàn)性hTERTp-EGFP片段和線(xiàn)性CMVp-EGFP片段連接，即可得到本實(shí)驗(yàn)所需要的hTERT/Tyr-IRES2-EGFP和CMVp/Tyr-IRES2-EGFP質(zhì)粒。采用酶切鑒定和測(cè)序鑒定驗(yàn)證我們所構(gòu)建質(zhì)粒的正確性。采用四質(zhì)粒包裝系統(tǒng)包裝并濃縮病毒，測(cè)定病毒滴度和最佳感

14、染MOI。
　　 2.慢病毒表達(dá)載體端粒酶靶向性檢測(cè)以及MR成像的體外研究
　　 pLenti-hTERT/Tyr-IRES2-EGFP與pLenti-CMV/Tyr-IRES2-EGFP慢病毒分別體外感染端粒酶陽(yáng)性HepG2、SGC7901、SW480細(xì)胞和端粒酶陰性U2OS細(xì)胞，共8株細(xì)胞，加上未感染病毒的對(duì)應(yīng)的4株細(xì)胞，共12株細(xì)胞設(shè)定為靶細(xì)胞，其中CMV啟動(dòng)子感染的細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照組，hTERT啟動(dòng)子感染的端粒酶陰

15、性細(xì)胞U2OS以及未感染的細(xì)胞為陰性對(duì)照組，hTERT啟動(dòng)子感染端粒酶陽(yáng)性細(xì)胞為目標(biāo)實(shí)驗(yàn)組。采用激光共聚焦觀察各靶細(xì)胞EGFP的表達(dá)；采用RT-PCR檢測(cè)各靶細(xì)胞中酪氨酸酶mRNA表達(dá)情況；采用WB檢測(cè)各靶細(xì)胞中酪氨酸酶蛋白的表達(dá)情況；采用比色法檢測(cè)各靶細(xì)胞490nm處吸光度值，測(cè)定各細(xì)胞的酪氨酸酶活性；采用Fontana染色檢測(cè)各靶細(xì)胞中黑色素顆粒生成的情況；采用普魯士藍(lán)染色檢測(cè)各靶細(xì)胞與鐵離子按不同時(shí)間點(diǎn)共同孵育后，鐵離子吸附情況隨

16、時(shí)間點(diǎn)變化而變化的情況；采用MR掃描檢測(cè)各靶細(xì)胞與鐵離子按不同時(shí)間點(diǎn)共同孵育后對(duì)細(xì)胞MR信號(hào)變化的影響。
　　 3.慢病毒表達(dá)載體對(duì)腫瘤MR特異性診斷的體內(nèi)研究
　　 將分別感染了兩種慢病毒的SGC7901和U2OS細(xì)胞接種于SCID小鼠右側(cè)皮下，未感染慢病毒的對(duì)應(yīng)細(xì)胞對(duì)稱(chēng)接種在SCID小鼠左側(cè)皮下，制成荷瘤小鼠模型。采用3.0TMR掃描儀對(duì)小鼠進(jìn)行掃描，觀察CMV啟動(dòng)子和hTERT啟動(dòng)子腫瘤MR信號(hào)的變化；觀察端粒酶陽(yáng)

17、性腫瘤和陰性腫瘤MR信號(hào)的變化；觀察感染細(xì)胞和未感染細(xì)胞MR信號(hào)的變化，研究在hTERT啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下，MR報(bào)告基因酪氨酸酶基因?qū)Χ肆Ｃ戈?yáng)性腫瘤MR定性診斷的可行性。并利用小動(dòng)物熒光成像儀觀察所有小鼠兩側(cè)腫瘤在體或離體下綠色熒光蛋白的表達(dá)情況；同時(shí)將腫瘤標(biāo)本進(jìn)行Fontana染色和普魯士藍(lán)染色，觀察各腫瘤細(xì)胞內(nèi)部黑色素顆粒的生成情況以及鐵離子的吸附情況。
　　 三、結(jié)果
　　 1.pLenti-hTERT/Tyr-IRES

18、2-EGFP與pLenti-CMV/Tyr-IRES2-EGFP慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及其包裝
　　 酶切鑒定證實(shí)我們所構(gòu)建的質(zhì)粒中含有大小為1600bp的條帶，與MR報(bào)告基因酪氨酸酶基因的理論大小相吻合；測(cè)序結(jié)果經(jīng)與GENE BANK數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，也證實(shí)構(gòu)建的質(zhì)粒中含有酪氨酸酶全長(zhǎng)cDNA。提示已成功構(gòu)建了hTERT/Tyr-IRES2-EGFP與CMV/Tyr-IRES2-EGFP質(zhì)粒；經(jīng)慢病毒4質(zhì)粒系統(tǒng)包裝后，檢測(cè)其滴度達(dá)

19、108數(shù)量級(jí)。
　　 2.慢病毒表達(dá)載體端粒酶靶向性檢測(cè)以及MR成像的體外研究
　　 激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示在端粒酶陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞中(SGC-7901胃癌細(xì)胞、HepG2肝癌細(xì)胞、SW480結(jié)腸癌細(xì)胞)，CMV和hTERT啟動(dòng)子慢病毒感染后均有EGFP的表達(dá)，而端粒酶陰性的U2OS骨肉瘤細(xì)胞只有CMV啟動(dòng)子慢病毒感染后有EGFP表達(dá)，hTERT啟動(dòng)子慢病毒感染后則沒(méi)有EGFP的表達(dá)；RT-PCR和WB結(jié)果顯示端粒酶陽(yáng)性

20、的上述細(xì)胞CMV和hTERT啟動(dòng)子病毒感染后均具有酪氨酸酶mRNA和蛋白的表達(dá)，而端粒酶陰性的細(xì)胞只有CMV啟動(dòng)子感染后的有酪氨酸酶mRNA和蛋白的表達(dá)，hTERT啟動(dòng)子病毒感染后則沒(méi)有酪氨酸酶mRNA和蛋白的表達(dá)；A490結(jié)果顯示端粒酶陽(yáng)性的上述細(xì)胞CMV和hTERT啟動(dòng)子病毒感染后以及端粒酶陰性細(xì)胞CMV啟動(dòng)子感染后，細(xì)胞具有較強(qiáng)的酪氨酸酶活性，且顯著高于端粒酶陰性細(xì)胞hTERT啟動(dòng)子病毒感染后的細(xì)胞以及未感染的細(xì)胞(p<0.01)

21、；Fontana染色結(jié)果表明，具有酪氨酸酶活性的各株細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)棕褐色銀沉著顆粒，而沒(méi)有酪氨酸酶活性的細(xì)胞內(nèi)則缺乏此棕褐色顆粒；普魯士藍(lán)結(jié)果顯示經(jīng)與鐵離子按不同時(shí)間點(diǎn)共同孵育后，具有酪氨酸酶活性的細(xì)胞內(nèi)隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量藍(lán)染的鐵顆粒沉著，在36h-48h以后達(dá)到峰值，而沒(méi)有酪氨酸酶活性的細(xì)胞內(nèi)則僅見(jiàn)少量藍(lán)染鐵顆粒沉著，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，沉著的鐵顆粒未見(jiàn)明顯增加；MR掃描結(jié)果顯示，具有酪氨酸酶活性的細(xì)胞團(tuán)其T1WI信號(hào)強(qiáng)

22、度隨著與鐵離子孵育時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯增加，且顯著高于沒(méi)有酪氨酸酶活性的細(xì)胞團(tuán)(p<0.01)。
　　 3.慢病毒表達(dá)載體對(duì)不同腫瘤細(xì)胞MR分子影像診斷的體內(nèi)研究
　　 體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果顯示SICD小鼠右側(cè)感染CMV啟動(dòng)子慢病毒的端粒酶陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞SGC7901和端粒酶陰性腫瘤細(xì)胞U2OS在MR掃描T1WI像上信號(hào)強(qiáng)度明顯高于左側(cè)未感染病毒的SGC7901和U2OS細(xì)胞(p<0.05)；SCID小鼠右側(cè)感染hTERT啟動(dòng)子病毒的

23、端粒酶陰性腫瘤細(xì)胞U2OS在MR掃描T1WI像上信號(hào)強(qiáng)度與小鼠左側(cè)未感染病毒的U2OS腫瘤細(xì)胞信號(hào)強(qiáng)度相似(p>0.05)，而小鼠右側(cè)感染hTERT啟動(dòng)子的端粒酶陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞SGC7901在MR掃描T1WI像上信號(hào)強(qiáng)度明顯高于左側(cè)未感染病毒的SGC7901(p<0.05)；小動(dòng)物熒光成像結(jié)果顯示MR掃描信號(hào)增高的腫瘤均可見(jiàn)綠色熒光，MR掃描信號(hào)未增加的腫瘤則未見(jiàn)綠色熒光；Fontana染色結(jié)果顯示所有MR信號(hào)增高的腫瘤標(biāo)本中均有大量黑色

24、顆粒沉著，提示有黑色素小體生成，而信號(hào)未增高的腫瘤標(biāo)本中則未見(jiàn)黑色顆粒沉著；普魯士藍(lán)染色結(jié)果顯示MR信號(hào)增高的腫瘤標(biāo)本內(nèi)部可見(jiàn)大量藍(lán)染鐵顆粒，而信號(hào)未增高的腫瘤標(biāo)本中則僅見(jiàn)少量散在的藍(lán)染鐵顆粒沉著。
　　 四、結(jié)論
　　 1.在前期研究基礎(chǔ)之上，成功改構(gòu)了基于hTERT啟動(dòng)子的含有MR報(bào)告基因(酪氨酸酶基因)的端粒酶陽(yáng)性腫瘤特異性診斷的慢病毒表達(dá)載體，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)該病毒同樣具有嚴(yán)格的端粒酶靶向性。
　　 2.該