胰島素對(duì)糖尿病鼠皮膚創(chuàng)傷的促愈合機(jī)制與大鼠胰島細(xì)胞的分離純化.pdf

1、目的：糖尿病(DM)是目前嚴(yán)重危害人類健康的常見病、多發(fā)病。全世界約有2％～5％的人患有此種疾病。我國(guó)在2000年DM患病人數(shù)就已達(dá)到3000多萬(wàn)，且呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)，因此預(yù)防和治療DM已成為國(guó)家科技攻關(guān)的重要項(xiàng)目。有人報(bào)NDM病人皮膚潰瘍或外科術(shù)后難愈合傷口可局部應(yīng)用胰島素(INS)來(lái)促進(jìn)其愈合，但其具體機(jī)制仍不清楚。本研究首先建立DM大鼠創(chuàng)面難愈模型，在不同時(shí)間點(diǎn)觀察了表皮干細(xì)胞(ESCs)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，然后在創(chuàng)傷局部應(yīng)用INS，觀

2、察某個(gè)時(shí)間點(diǎn)ESCs和創(chuàng)面愈合率的變化，并探討了二者之間的關(guān)系及機(jī)制，為臨床研究和治療DM創(chuàng)傷提供了科學(xué)基礎(chǔ)。 DM患者容易并發(fā)皮膚潰瘍或創(chuàng)傷后難以愈合，常常成為DM患者致死致殘的重要原因之一。目前的研究認(rèn)為，DM創(chuàng)面難愈的機(jī)制主要集中在以下幾方面：①糖代謝紊亂及其晚期糖基化終末產(chǎn)物增多；②微血管的改變；③基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)異常；④表皮生長(zhǎng)因子受體的改變；⑤表皮細(xì)胞增殖障礙。在創(chuàng)面愈合過(guò)程中，這些因素都不是單獨(dú)發(fā)生的，而是以一

3、個(gè)高度協(xié)調(diào)、互相影響的方式進(jìn)行的。而ESCs是組織特異性干細(xì)胞，具有強(qiáng)大的增殖能力，既能自我更新以維持ESCs數(shù)量平衡，又可向各階段表皮細(xì)胞分化以維持皮膚代謝，尤其在皮膚發(fā)生創(chuàng)傷時(shí)，ESCs更是皮膚重建的關(guān)鍵“種子細(xì)胞”。那么，DM創(chuàng)傷后ESCs的變化是否有別于正常狀態(tài)仍不清楚。此外，臨床上有局部使用小量INS溶液加速傷口愈合的經(jīng)驗(yàn)，其是否通過(guò)啟動(dòng)ESCs起作用仍待進(jìn)一步研究。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)常規(guī)HE染色、免疫組化染色和Westem

4、 blot等方法觀察了DM大鼠創(chuàng)傷后不同時(shí)期表皮厚度、ESCs的數(shù)量變化和分布特征及創(chuàng)面愈合率，進(jìn)而探討了ESCs與DM皮膚創(chuàng)面難愈之間的關(guān)系。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了DM創(chuàng)面局部應(yīng)用INS后ESCs的定位、數(shù)量及創(chuàng)面愈合率的變化，并對(duì)兩者之間是否存在相關(guān)關(guān)系進(jìn)行了探討，從而進(jìn)一步明確了創(chuàng)面局部應(yīng)用INS是否通過(guò)ESCs發(fā)揮了促進(jìn)DM創(chuàng)面愈合的作用。此外，又進(jìn)行了Wistar大鼠胰島細(xì)胞的分離和純化，為以后對(duì)ESCs進(jìn)行基因改造或與支架

5、聯(lián)合培養(yǎng)移植促進(jìn)DM創(chuàng)面愈合提供了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法: 1、建立模型將體重為180～200g的雄性Wistar大鼠(68只)隨機(jī)分為模型組(44只)和正常組(24只)。前者采用腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ，65mg/kg)的方法制作DM模型。成模3周后，用特制打孔器在兩組所有大鼠的背部、脊柱兩側(cè)各打一直徑為1.8cm、面積為2.54cm<'2>的創(chuàng)面，作為創(chuàng)面難愈模型。然后從模型組中隨機(jī)挑選2

6、4只作為DM組，正常組24只健康大鼠作為對(duì)照，觀察DM對(duì)皮膚創(chuàng)傷后ESCs的影響。再?gòu)哪Ｐ徒M中隨機(jī)挑選12只大鼠，分為對(duì)照組(6只)和實(shí)驗(yàn)組(6只)，觀察局部應(yīng)用INS后對(duì)DM創(chuàng)面中：ESCs的影響。 2、觀察DM對(duì)皮膚創(chuàng)傷后創(chuàng)面中ESCs的影響對(duì)DM組和正常組中大鼠的創(chuàng)面止血后用無(wú)菌紗布包扎，以后每日清潔創(chuàng)面。于創(chuàng)面制作后第3d、7d、14d和21d觀察大鼠皮膚愈合及感染情況，計(jì)算創(chuàng)面愈合一率；·同時(shí)在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組處死6只大

7、鼠，取其創(chuàng)緣及肉芽組織，固定，常規(guī)石蠟包埋，切片。按每連續(xù)3張切片為一組，分別編號(hào)為A、B、C。A組行HE染色，觀察創(chuàng)面組織學(xué)變化及測(cè)量表皮厚度；B組和C組分別行K19和β1整合素免疫組織化學(xué)染色，觀察ESCs的數(shù)量和位置的變化。 3、觀察局部應(yīng)用INS對(duì)DM創(chuàng)面中ESCs的影響從創(chuàng)傷后第1d開始，對(duì)實(shí)驗(yàn)組大鼠創(chuàng)面局部施加INS治療(8U/只)，而對(duì)對(duì)照組大鼠則施加等量生理鹽水做對(duì)照，隔日一次。在第一次施加INS前及施加后第1h

8、，2h，3h，4h，6h，12h和24h測(cè)量所有大鼠血糖濃度。創(chuàng)傷后第14d，所有大鼠被處死，測(cè)量創(chuàng)面面積，同時(shí)取創(chuàng)緣皮膚，一部分用4％多聚甲醛固定，行HE染色、K19和β1整合素的免疫組化染色，另一部分于-70℃冷凍保存，用Westem blot的方法檢測(cè)K19和β1整合素蛋白的相對(duì)含量。 4、Wistar大鼠胰島細(xì)胞的分離與純化采用肝胰管內(nèi)灌注膠原酶的方法消化分離胰島，F(xiàn)ico11400密度梯度離心純化。 純化后的胰

9、島經(jīng)組織學(xué)染色、電鏡及放射免疫來(lái)鑒定其特異性和活力。 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均以X±s表示，用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)論: 1、創(chuàng)傷前后，DM大鼠皮膚中的ESCs的數(shù)量和位置均發(fā)生了變化。ESCs的數(shù)量少和活性低是導(dǎo)致DM創(chuàng)面愈合延遲的重要原因。 2、局部應(yīng)用INS后，DM大鼠創(chuàng)緣組織中ESCs的數(shù)量增多，從而促進(jìn)了DM大鼠的創(chuàng)面愈合。 3、肝胰管內(nèi)灌注膠原酶消化法是一種可獲得較多胰島細(xì)胞