大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與胰島細(xì)胞共培養(yǎng)及對(duì)糖尿病大鼠的治療.pdf

1、目的：對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Borle Marrow Mesench-ymal Stem Cells，BMSCs）進(jìn)行分離培養(yǎng)、體外擴(kuò)增，與大鼠胰島細(xì)胞共培養(yǎng)分化為胰島樣細(xì)胞，采用雙硫腙染色對(duì)誘導(dǎo)分化的胰島樣細(xì)胞進(jìn)行鑒定、化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)其胰島素水平。將共培養(yǎng)后的細(xì)胞及未經(jīng)共培養(yǎng)的MSCs通過(guò)尾靜脈移植入糖尿病大鼠體內(nèi)，通過(guò)對(duì)血糖的檢測(cè)，觀察其對(duì)糖尿病大鼠的治療效果。
　　 方法：
　　 1、取3-4周齡的雄性SD大鼠，

2、采用percoll密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離純化BMSCs，傳代擴(kuò)增，倒置相差顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。取第4代細(xì)胞與胰島細(xì)胞共培養(yǎng)，按實(shí)驗(yàn)分為3組：①PBS組；②BMSCs組；③BMSCs和胰島細(xì)胞共培養(yǎng)組。
　　 2、取3-4周齡的雄性SD大鼠，采用逐級(jí)消化及篩網(wǎng)過(guò)濾方法分離純化胰島細(xì)胞，雙硫腙染色證明所收集的細(xì)胞為胰島細(xì)胞。
　　 3、對(duì)共培養(yǎng)后細(xì)胞進(jìn)行鑒定：倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；雙硫腙染色法對(duì)共培

3、養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定；化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)MSCs組與MSCs和胰島細(xì)胞共培養(yǎng)組細(xì)胞對(duì)葡萄糖刺激試驗(yàn)的反應(yīng)；RT-PCR檢測(cè)共培養(yǎng)組細(xì)胞pdx-1的表達(dá)。
　　 4、將18只雄性SD大鼠通過(guò)腹腔注射鏈脲佐菌素破壞胰腺造成糖尿病大鼠模型，分為：PBS組、MSCs組、MSCs與胰島細(xì)胞共培養(yǎng)組。將Brdu標(biāo)記的細(xì)胞從尾靜脈移植入糖尿病大鼠模型體內(nèi)，觀察臨床療效，免疫組織化學(xué)染色確定Brdu標(biāo)記的細(xì)胞及胰島素抗體在胰腺的分布。
　　 結(jié)果

4、：
　　 1、MSCs接種初期可見大量懸浮細(xì)胞，24小時(shí)后觀察大部分細(xì)胞開始貼壁。貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞呈單個(gè)分散存在或形成數(shù)個(gè)細(xì)胞克隆，逐漸伸腳變形，呈圓形、多角形、長(zhǎng)梭形等多種形態(tài)。傳至第3代，細(xì)胞純化，形態(tài)較為單一，呈長(zhǎng)梭形貼壁生長(zhǎng)，以平行排列為主或呈漩渦狀生長(zhǎng)。
　　 2、胰島細(xì)胞呈圓形或橢圓形，大小不一，外包完整而清晰的被膜而形成細(xì)胞團(tuán)，即為胰島。培養(yǎng)3天前，細(xì)胞呈團(tuán)鎖狀結(jié)構(gòu)。4-7天時(shí)，形成均一的單層細(xì)胞，集聚生長(zhǎng)，

5、生長(zhǎng)狀態(tài)良好。培養(yǎng)7天后，細(xì)胞碎片逐漸增多。雙硫腙染色鏡下觀察細(xì)胞團(tuán)被染成棕紅色，證明所收集的細(xì)胞為胰島細(xì)胞。
　　 3、取更為純化的第4代MSCs與胰島細(xì)胞共培養(yǎng)，第3天時(shí)MSCs形態(tài)略有變化，但大多數(shù)仍為長(zhǎng)梭形，極少數(shù)呈多角形或圓形，折光性明顯增強(qiáng)，第6天變圓的MSCs明顯增多，大部分形成細(xì)胞團(tuán)，第9天進(jìn)一步增多。
　　 4、雙硫腙染色檢測(cè)MSCs與胰島細(xì)胞共培養(yǎng)組細(xì)胞胰島素的合成。光學(xué)顯微鏡下觀察大部分細(xì)胞團(tuán)被染成

6、棕紅色，而MSCs組則無(wú)染色，表明共培養(yǎng)的細(xì)胞胞漿中富含鋅離子，證明胰島素分泌細(xì)胞的存在。
　　 5、MSCs與胰島細(xì)胞共培養(yǎng)組經(jīng)低糖和高糖刺激后用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)有胰島素分泌，且經(jīng)高糖刺激后胰島素分泌量高于低糖刺激，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而MSCs組則無(wú)胰島素分泌。
　　 6、RT-PCR檢測(cè)MSCs組與MSCs和胰島細(xì)胞共培養(yǎng)組細(xì)胞pdx-1的表達(dá)。MSCs組細(xì)胞不表達(dá)pdx-1，MSCs和胰島細(xì)胞共培養(yǎng)

7、組3天的細(xì)胞表達(dá)pdx-1，6天時(shí)pdx-1表達(dá)進(jìn)一步增高，14天無(wú)pdx-1表達(dá)。
　　 7、腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）3天后檢測(cè)大鼠血糖。造模組大鼠血糖≥16.7mmol/L且穩(wěn)定兩天，并可觀察到大鼠出現(xiàn)多飲、多尿等癥狀，可判定大鼠糖尿病模型造模成功。各組大鼠糖尿病模型均造模成功。
　　 細(xì)胞移植后用血糖儀檢測(cè)大鼠尾靜脈血糖，PBS組血糖較移植前無(wú)明顯下降（P>0.05），MSCs組及

8、共培養(yǎng)組血糖移植后14天血糖開始下降，與移植前相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），共培養(yǎng)組移植后血糖較MSCs組血糖下降明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。并可觀察到MSCs及共培養(yǎng)組大鼠多飲、多食、多尿癥狀改善，皮毛干凈，反應(yīng)靈敏，墊料干燥。
　　 8、免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)移植后Brdu標(biāo)記細(xì)胞及胰島素抗體在糖尿病大鼠胰腺的分布，MSCs組及共培養(yǎng)組Brdu標(biāo)記的細(xì)胞在細(xì)胞核顯色，為棕黑色。其相應(yīng)的胰島素表達(dá)陽(yáng)性，主

9、要顯色在胞漿，為棕紅色。在PBS組胰腺未發(fā)現(xiàn)Brdu標(biāo)記細(xì)胞及胰島素表達(dá)陽(yáng)性。
　　 結(jié)論：
　　 1、通過(guò)密度梯度離心法及貼壁篩選法聯(lián)合應(yīng)用去除雜細(xì)胞效果好，在體外可獲得純化的BMSCs。
　　 2、通過(guò)逐級(jí)消化、轉(zhuǎn)瓶及篩網(wǎng)過(guò)濾方法可得到數(shù)量較多及純化的胰島細(xì)胞，培養(yǎng)至3-7天時(shí)，適于體外實(shí)驗(yàn)研究。
　　 3、大鼠MSCs與胰島細(xì)胞共培養(yǎng)后可分化為胰島樣細(xì)胞，且對(duì)葡萄糖刺激出現(xiàn)反應(yīng)，初步具有模擬體內(nèi)β細(xì)