雞精原細胞分離純化與體外初步培養(yǎng).pdf

1、本研究通過對不同時期雞胚睪丸組織，以不同的酶組合方式以及不同的消化步驟分離獲取精原細胞，以期獲得最佳的酶消化組合和最適宜的雞精原細胞提取時間；同時在前期確定的分離方法基礎上進一步采用percoll梯度離心，并結合睪丸細胞不同的貼壁速度進行純化，為建立雞精原細胞的分離、純化探索適宜的途徑；此外，本研究還初步研究了雞精原細胞在有無飼養(yǎng)層和有無體細胞存在情況下體外生長特性，從而為雞精原細胞的體外長期培養(yǎng)、建系及體外研究精子發(fā)生和轉基因動物的生

2、產提供有價值的參考依據。結果總結如下幾點：1.分別采用“1mg/ml膠原酶+0.25％胰蛋白酶+0.25％胰蛋白酶”、“1mg/ml膠原酶+1.5mg/ml透明質酸酶/0.25％胰蛋白酶”和“1mg/ml膠原酶+研磨+0.25％胰蛋白酶”三種方法消化雞睪丸組織，結果發(fā)現：雞睪丸組織經“1mg/ml膠原酶+0.25％胰蛋白酶+0.25％胰蛋白酶”消化處理后，獲得的細胞活率(94.4％)和每睪活細胞數(3.24×105)比經“1mg/ml膠

3、原酶+1.5mg/ml透明質酸酶/0.25％胰蛋白酶”和“1mg/ml膠原酶+研磨+0.25％胰蛋白酶”的處理分別高3.8％，1.04×105和5.1％，0.44×105；當從孵化15d、19d雞胚和出雛后6d、13d公雞睪丸組織中分離精原細胞時發(fā)現，出雛后6d左右公雞獲得的精原細胞數約為33.8％，比孵化15d、19d雞胚和出雛后13d公雞分別高2.6％、4.3％和3.1％。結果表明：以“1mg/ml膠原酶+0.25％胰蛋白酶+0.2

4、5％胰蛋白酶”的二酶三步消化法分離出雛后6d公雞的睪丸組織能獲得較高的細胞活率和較多的每睪活細胞數與精原細胞數。 2.雞睪丸組織經酶消化處理后，獲得的細胞懸液進一步經percoll密度梯度離心和體外貼壁培養(yǎng)純化，結果發(fā)現：細胞懸液經percoll梯度分選后，精原細胞主要位于19％～35％梯度層中，純度平均達到66.4％，再進一步貼壁培養(yǎng)純化后精原細胞純度則可達82％，比未經貼壁純化的精原細胞純度高出15.6％。說明以percol

5、l梯度離心和體外貼壁培養(yǎng)純化雞精原細胞，能獲得較高的精原細胞純度。 3.本研究分別比較了percoll分離前、后精原細胞在有、無飼養(yǎng)層條件下的培養(yǎng)情況，結果顯示：①在有飼養(yǎng)層條件下，未經percoll分離的精原細胞懸液體外培養(yǎng)5h后，精原細胞開始貼壁；接種24h后，貼壁的體細胞已鋪展成不規(guī)則形狀，而貼壁的精原細胞仍呈圓形。接種48h后，精原細胞開始緩慢增殖，培養(yǎng)體系中多個一串或一團的精原細胞顯著增多；接種96h后，少數精原細胞逐

6、漸脫離支持細胞和飼養(yǎng)層細胞，隨換液而被棄去。培養(yǎng)1周之后，精原細胞開始緩慢的退化，但數量卻沒有明顯的減少，在體系中維持著動態(tài)的平衡。②無飼養(yǎng)層條件下，睪丸細胞懸液接種6h左右，少數精原細胞開始貼壁；培養(yǎng)24h后，貼壁的支持細胞已開始鋪展成不規(guī)則形狀，精原細胞仍呈圓形散在地鑲嵌于支持細胞層之上；培養(yǎng)48h后，已有兩個一串的精原細胞出現，但數量較少；培養(yǎng)72h后，2個或多個一串的精原細胞開始增多，但同時游離的精原細胞也增多；培養(yǎng)5d，大部分