從蛋白表達譜的改變研究化學(xué)致癌劑MNNG誘發(fā)細胞應(yīng)答反應(yīng)的量效及時效關(guān)系.pdf

1、單功能烷化劑N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)是一種在實驗室中普遍使用的模式化學(xué)誘變劑和致癌劑,用于研究環(huán)境中廣泛存在的Ⅳ.亞硝胺類誘變劑和致癌劑的致癌機制.它能和DNA及蛋白質(zhì)等生物大分子形成加合物(adduct),這些加合物最終可能導(dǎo)致染色體異常,點突變和細胞死亡.其引起的與突變有關(guān)的主要DNA損傷類型是O<'6>-甲基鳥嘌呤,這種損傷與許多腫瘤的發(fā)生密切相關(guān).此外,環(huán)境誘變劑引起的突變也可發(fā)生在非DNA損傷部位,即非定標

2、性突變(nontargctcd mutagenesis).我們實驗室就曾用一個特殊的突變檢測系統(tǒng)直接證明了低濃度(0.2μM)的短壽烷化劑MNNG(半壽期為1.1hr)可在哺乳動物細胞中誘發(fā)非定標性突變,且這種非定標性突變依賴于基因表達的改變.本實驗室還證明了在低濃度MNNG處理下發(fā)生了廣泛的細胞反應(yīng):DNA復(fù)制保真度的下降和DNA聚合酶譜的改變:細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路cAMP-PKA-CREB和JNK/SAPK被激活;細胞表面受體如表皮生長

3、因子受體EGFR、腫瘤壞死因子受體TNFR發(fā)生聚簇;EGFR信號通路發(fā)生阻斷:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生等. 為了進一步了解化學(xué)致癌物誘發(fā)哺乳動物細胞應(yīng)答反應(yīng)的全貌,本實驗室還利用了高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對低濃度MNNG處理后細胞基因表達譜的改變進行了初步研究.結(jié)果發(fā)現(xiàn)有60多個蛋白斑點發(fā)生了變化,其中有36個被成功鑒定.這些被鑒定蛋白的功能涉及非常廣泛,更提示了我們細胞應(yīng)答反應(yīng)的復(fù)雜性.同時我們考慮到細胞的應(yīng)答反應(yīng)往往是連續(xù)的、動態(tài)

4、的,如果我們只孤立地研究某個作用點時的反應(yīng)情況可能是不夠的,因此進行不同濃度的量效研究和不同時間的時效研究就顯得十分必要了. 主要結(jié)果: 1.在本研究中,首先根據(jù)已有的研究成果和相關(guān)文獻確定了低(0.25μM)、中(lμM)、高(10μM)三個不同的MNNG處理劑量,經(jīng)蛋白質(zhì)組學(xué)的大規(guī)模篩選后發(fā)現(xiàn)共有85個蛋白斑點發(fā)生了顯著的變化,并且成功鑒定了其中的71個,鑒定成功率為83.5﹪.這些蛋白的功能涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、

5、代謝、DNA修復(fù)和細胞周期調(diào)控等.我們發(fā)現(xiàn),在這些得到成功鑒定的蛋白中,僅有少數(shù)的蛋白在不同濃度MNNG處理后都有表達水平的改變,其它絕大多數(shù)蛋白表達水平的改變在不同濃度組是相對獨立的.這說明處理劑量與效應(yīng)之間并不是單純的線性關(guān)系,高濃度處理組并不是低濃度處理組的簡單放大.此外,值得注意的是隨著處理濃度的增高,表達上調(diào)蛋白的比例減小,而表達下調(diào)蛋白的比例卻增加.我們認為這和處理濃度增高后細胞毒性作用的增強是密切相關(guān)的. 2.經(jīng)過

6、量效研究后,選擇了對細胞毒性作用相對較小而細胞反應(yīng)相對較明顯的中濃度(lμM)處理劑量進行下一步的時效研究.選擇MNNG處理后分別恢復(fù)3小時、12小時和24小時的細胞展開了蛋白質(zhì)組學(xué)的分析.結(jié)果找到了78個差異表達點,其中的64個蛋白點得到了鑒定,鑒定成功率為82﹪.為了盡可能多的鑒定差異表達蛋白,我們又運用了合作研究的成果--微流控固相萃取(solid-phase extracfion,SPE)裝置,將鑒定成功率提高到了90﹪.這些得

7、到成功鑒定的蛋白質(zhì)的功能主要涉及細胞周期調(diào)控、代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等.從結(jié)果中看,差異表達蛋白的數(shù)量在12小時組達到最多,而24小時組不僅數(shù)量最少而且改變的幅度都比較小.這說明細胞對環(huán)境有毒刺激的應(yīng)激反應(yīng)可能主要集中在12小時左右或以內(nèi),在此后更長的時間(如24小時左右)細胞已經(jīng)逐漸恢復(fù)并度過應(yīng)激狀態(tài)了. 3.結(jié)合低濃度MNNG處理細胞后培養(yǎng)上清的蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)核型dUTP焦磷酸酶蛋白在細胞裂解總蛋白的差異蛋白圖譜中發(fā)生

8、下調(diào),同時又出現(xiàn)在細胞外液中.結(jié)果的準確性經(jīng)Western blot方法證明.提示該蛋白可以作為監(jiān)測人群接觸環(huán)境致癌物后有效的早期生物標記物. 4.由于細胞在應(yīng)對環(huán)境有害因素刺激時很多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活及重要反應(yīng)事件的發(fā)生都要通過細胞核,所以細胞核內(nèi)蛋白的改變也是我們關(guān)注的重點之一.由于細胞總蛋白提取液中含有的大部分是胞漿內(nèi)的可溶蛋白,而核蛋白因為相對豐度較低可能覆蓋不全,因此我們又分析了低(0.25μM)、中(1μM)濃度M

9、NNG處理后細胞核蛋白的差異圖譜,并且采用了準確性更高、上樣量更低的熒光差異雙向凝膠電泳(2-D DIGE)技術(shù).經(jīng)過比對,我們發(fā)現(xiàn)共有24個蛋白點的含量發(fā)生了改變,其中18個蛋白點被成功鑒定.這些蛋白大部分屬于14-3-3蛋白家族、異質(zhì)性胞核核糖核蛋白(hnRNPs)家族和結(jié)構(gòu)蛋白家族.值得一提的是,盡管低、中濃度MNNG處理后細胞總蛋白的差異圖譜中共同的蛋白很少,但在核蛋白的研究中卻發(fā)現(xiàn)24個差異蛋白點中有10個蛋白是相同的,這提示

10、我們低、中濃度MNNG處理后細胞發(fā)生的核內(nèi)事件中有共同之處. 5.差異表達蛋白質(zhì)的Western blot驗證:從成功得到質(zhì)譜鑒定的蛋白質(zhì)中,選擇RanGAP1、14-3-3 β和14-3-3 ε進行Western blot驗證.結(jié)果表明Western blot分析得到的結(jié)桌與蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果基本一致,說明本實驗中蛋白質(zhì)組學(xué)的分析結(jié)果是可信的. 主要結(jié)論: 1.通過對暴露于化學(xué)致癌劑MNNG后哺乳細胞量效及時效

11、反應(yīng)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究,分別發(fā)現(xiàn)了85個和78個蛋白的表達量發(fā)生了改變,說明MNNG作用后細胞內(nèi)發(fā)生了廣泛而復(fù)雜的變化,有眾多蛋白參與了應(yīng)答反應(yīng),這些蛋白涉及到細胞的不同功能. 2.研究發(fā)現(xiàn)僅有極少數(shù)蛋白有劑量依賴關(guān)系和時間依賴關(guān)系,說明不同濃度MNNG暴露及暴露不同時間后細胞應(yīng)答反應(yīng)機制是不一樣的,高濃度MNNG作用后,細胞應(yīng)答反應(yīng)體系不是低濃度作用后的簡單放大,存在更為復(fù)雜的致毒機制;不同濃度MNNG作用不同時間后,可能先后依

12、次激活細胞內(nèi)的不同通路來誘發(fā)其應(yīng)答反應(yīng)和產(chǎn)生毒性效應(yīng). 3.結(jié)合低濃度MNNG處理細胞后培養(yǎng)上清的蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)的核型dUTP焦磷酸酶蛋白,可以作為監(jiān)測人群接觸環(huán)境致癌物后可能的早期生物標志物. 4.對低、中濃度MNNG處理后細胞核蛋白差異圖譜的進一步分析發(fā)現(xiàn),14-3-3蛋白家族和異質(zhì)性胞核核糖核蛋白(hnRiPs)家族發(fā)生了較為明顯的改變.并且兩個濃度的核蛋白差異圖譜具有較大的相似性,這提示我們低、中濃度MN