USP22基因在肝細胞癌中的表達及其表達下調(diào)對肝癌細胞增殖的影響.pdf

1、目的:原發(fā)性肝細胞肝癌(HCC)在世界上最常見的惡性腫瘤中排位第五，在我國癌癥病死率中位居第二位。目前，肝癌的分子靶向治療逐漸引起人們的重視，及時發(fā)現(xiàn)潛在的治療靶點可能為肝癌的分子靶向治療帶來新的突破。泛素水解酶22(Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 22，USP22)是新發(fā)現(xiàn)的泛素水解酶家族成，可作用于泛素-蛋白酶體系統(tǒng)中泛素化的蛋白底物，通過切斷泛素鏈與底物蛋白之間的連接，而發(fā)揮廣泛的生物學(xué)

2、功能，其已證明與多種腫瘤惡性程度、增殖、轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)，其在肝癌中的表達情況尚不清楚。本實驗檢測了USP22mRNA及蛋白在肝癌組織及細胞中的表達水平，探討USP22基因表達的高低對肝細胞性肝癌患根治術(shù)后無復(fù)發(fā)生存時間（RFS）和總生存時間(OS)的影響及其臨床價值，設(shè)計并合成了針對USP22基因的特異性siRNA，并轉(zhuǎn)染人肝癌細胞系HepG3B，沉默USP22基因在HepG3B細胞中的表達，初步探討USP22基因?qū)Ω伟〩epG3B細胞

3、增殖、細胞凋亡以及細胞周期的影響。
　　方法:1.于桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2003年5月至2008年5月間手術(shù)切除的標本，選取104例肝細胞癌組織及對應(yīng)的癌旁組織，6例正常的肝組織（來自肝血管瘤患者），用免疫組化檢測泛素水解酶22(USP22)在肝癌組織及相應(yīng)癌旁組織中的表達情況。
　　2.提取112例肝細胞癌組織及對應(yīng)的癌旁組織，6例正常的肝組織中總RNA，RT-PCR檢測泛素水解酶22(USP22)在肝癌組織、相應(yīng)癌旁組織及

4、正常肝組織中的表達情況，使用Image-J軟件檢測積分灰度值（integrated density value）計算后得出肝癌組織、相應(yīng)癌旁組織及正常肝組織中泛素水解酶22(USP22)的相對表達水平，分析其中的差異。
　　3.提取112例肝細胞癌組織及對應(yīng)的癌旁組織，6例正常的肝組織中總蛋白質(zhì)，Western blot檢測泛素水解酶22(USP22)在肝癌組織、相應(yīng)癌旁組織及正常肝組織中的表達情況，使用Image-J軟件檢測積分

5、灰度值（integrated density value）計算后得出肝癌組織、相應(yīng)癌旁組織及正常肝組織中泛素水解酶22(USP22)的相對表達水平，分析其中的差異。
　　4.采用受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析USP22基因表達強弱的分界點，將患者分為高表達組和低表達組，對高表達組和低表達組患者無復(fù)發(fā)生存時間(RFS)和總生存時間(OS)的關(guān)系進行單因素Kaplan-Meier分析和多因素Cox回歸分析。
　　5.常規(guī)培

6、養(yǎng)肝癌細胞HepG2、HepG3B、Bel-7402及正常肝細胞ChangLiver。取處于對數(shù)生長期的細胞，Trizol試劑提取總RNA，RT-PCR檢測泛素水解酶22(USP22)在上述肝癌及正常肝細胞中的表達情況，使用Image-J軟件檢測積分灰度值（integrated density value）計算后得出人肝癌細胞HepG2、HepG3B、Bel-7402及人正常肝細胞Changliver中泛素水解酶22(USP22)的相對

7、表達水平，分析其中的差異。
　　6.提取處于對數(shù)生長期的肝癌細胞HepG2、HepG3B、Bel-7402及正常肝細胞Chang Liver中總蛋白質(zhì)，Western blot檢測泛素水解酶22(USP22)在肝癌細胞及正常肝細胞中的表達情況，使用Image-J軟件檢測積分灰度值（integrated density value）計算后得出人肝癌細胞HepG2、HepG3B、Bel-7402及人正常肝細胞Chang liver中泛

8、素水解酶22(USP22)的相對表達水平，分析其中的差異。
　　7.通過Ambion網(wǎng)站設(shè)計針對泛素水解酶22(USP22)基因的特異性siRNA序列，并由上海吉瑪公司合成。采用處于對數(shù)生長期的肝癌細胞HepG3B，接種于6孔板中，待細胞鋪滿孔后用針對USP22基因的特異性siRNA合轉(zhuǎn)染肝癌細胞HepG3B;
　　8.USP22siRNA轉(zhuǎn)染HepG3B細胞48h后RT-PCR及Western blot檢測USP22mRN

9、A和蛋白表達水平，使用Image-J軟件檢測積分灰度值（integrated density value）計算后得出轉(zhuǎn)染USP22siRNA后HepG3B細胞中USP22相對表達水平的改變。
　　9.USP22siRNA轉(zhuǎn)染HepG3B細胞48h后，采用MTT法檢測細胞增殖活性，計算后得出轉(zhuǎn)染USP22siRNA后HepG3B細胞的生長抑制率;
　　10.USP22siRNA轉(zhuǎn)染HepG3B細胞48h后，采用流式細胞術(shù)測定細

10、胞凋亡率和細胞周期，比較沉默USP22基因后HepG3B細胞凋亡率和細胞周期的改變;
　　11.USP22siRNA轉(zhuǎn)染HepG3B細胞48h后，采用Western blot免疫印跡檢測CyclinD1、CDK4和CDK6細胞周期蛋白表達水平。
　　結(jié)果:免疫組化結(jié)果表明泛素水解酶22(USP22)在肝癌組織中的陽性表達率明顯高于相應(yīng)的癌旁組織和正常肝組織(p＜0.01);RT-PCR結(jié)果表明泛素水解酶22(USP22)RN

11、A在肝癌組織中的表達明顯高于相應(yīng)的癌旁組織和正常肝組織;采用ROC曲線分析用來確定USP22表達量的臨界值（＞3與≤3）。不論是在測試集中還是在整體病人中，單因素分析顯示，臨床TNM分期和Edmonsongrade分級均與USP22基因表達的強弱有關(guān)(均P＜0.05)。多因素分析顯示，當以USP22基因表達的強弱作為協(xié)變量進入Cox比例風(fēng)險模型時，其為影響患者RFS和OS的獨立危險因素(均P＜0.001)。多元分析顯示，USP22的表達

12、高低是HCC一個獨立的預(yù)后參數(shù)。Westernblot結(jié)果表明泛素水解酶22(USP22)蛋白在肝癌組織中的含量明顯高于相應(yīng)的癌旁組織和正常肝組織;RT-PCR及Westernblot檢測表明人肝癌細胞HepG2、HepG3B、Bel-7402中USP22的相對表達水平顯著高于人正常肝細胞Changlive;用針對泛素水解酶22(USP22)基因的特異性siRNA干擾肝癌細胞HepG3B后，HepG3B細胞中USP22表達水平明顯降低;

13、MTT法檢測其細胞生長抑制率為42.24％，明顯高于對照組(tsiUSP22組=22.47，p＜0.01);流式細胞儀檢測其細胞凋亡率為33.08％±4.53％，明顯高于對照組（tsiUSP22組=12.34，p＜0.01）;流式細胞儀檢測細胞周期，發(fā)現(xiàn)其處于G1期細胞的百分比為68.81％±2.71％，明顯高于對照組(tsiUSP22組=33.91，p＜0.01);Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)細胞周期蛋白CyclinD1、CDK4和

14、CDK6在USP22siRNA組中的表達水平明顯低于對照組（tCyclinD1=10.85，tCDK4=10.51，tCDK6=10.59,p＜0.01）。
　　結(jié)論:泛素水解酶22(USP22)在肝癌組織中的表達明顯高于相應(yīng)的癌旁組織和正常肝組織;在人肝癌細胞HepG2、HepG3B、Bel-7402中USP22的表達明顯高于人正常肝細胞Changliver;USP22的表達高低是影響HCC患者預(yù)后的獨立危險因素，其對HCC患者