極早產(chǎn)兒主要臨床問(wèn)題回顧性分析及人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞制備研究.pdf

1、第一部分極早產(chǎn)兒主要臨床問(wèn)題回顧性分析
　　 目的:
　　 極早產(chǎn)兒(very preterm infants，VPT，胎齡＜32wk)由于其解剖生理特點(diǎn)，易發(fā)生各種并發(fā)癥，病死率及后遺癥的發(fā)生率較高，對(duì)極早產(chǎn)兒周密的全面管理，是新生兒監(jiān)護(hù)病房(NICU)中體現(xiàn)水平的綜合反映。國(guó)內(nèi)在極早產(chǎn)兒NICU救治、預(yù)后等方面研究資料匱乏。本研究通過(guò)回顧性分析超大容量NICU極早產(chǎn)兒臨床病例資料，旨在了解:(1)極早產(chǎn)兒圍生期特征、

2、NICU中主要疾病構(gòu)成、治療手段及疾病負(fù)擔(dān);(2)極早產(chǎn)兒存活率、主要并發(fā)癥患病比例以及預(yù)后的高危因素;(3)新生兒轉(zhuǎn)運(yùn)以及超大容量NICU對(duì)極早產(chǎn)兒臨床轉(zhuǎn)歸的影響;(4)國(guó)內(nèi)極早產(chǎn)兒救治現(xiàn)狀與發(fā)達(dá)國(guó)家救治情況比較。希望通過(guò)此文研究為當(dāng)前極早產(chǎn)兒救治難點(diǎn)、重點(diǎn)提供可靠的臨床研究資料，為更大規(guī)模的極早產(chǎn)兒流行病學(xué)研究提供重要的理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 回顧性收集2010年10月1日至2011年09月30日連續(xù)12個(gè)月

3、內(nèi)，八一兒童醫(yī)院極早產(chǎn)NICU中收治的極早產(chǎn)兒病例資料。病例納入標(biāo)準(zhǔn):出生胎齡(GA)小于32wk、生后24小時(shí)內(nèi)入住極早產(chǎn)NICU者。
　　 用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料中連續(xù)變量呈正態(tài)分布者表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析;偏態(tài)分布者表示為中位數(shù)（范圍或四分位數(shù)間距），組間均數(shù)比較采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以發(fā)生率或構(gòu)成比表示，并對(duì)發(fā)生率作區(qū)間估計(jì)，發(fā)生率或構(gòu)成比的比較采用卡方檢驗(yàn)。因本研究為回

4、顧性分析，結(jié)合研究人群特點(diǎn)，采用單因素Logistic回歸模型對(duì)極早產(chǎn)兒死亡高危因素分析，進(jìn)一步運(yùn)用多因素Logistic回歸模型進(jìn)行多因素逐步回歸分析以明確死亡的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。變量間相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。
　　 結(jié)果:
　　 1.人口學(xué)特征
　　 本次研究共收集病例1262份，符合入選標(biāo)準(zhǔn)的病例729例。其中164例為超早產(chǎn)兒（胎齡，GA≤28wk），占總數(shù)的22.5％;478例為極低出生體重

5、兒(VLBW＜1500 g)，占總數(shù)的65.6％;68例為超低出生體重兒(ELBW＜1000 g)，占總數(shù)的9.3％。平均GA為29.8±1.4（范圍23.9-31.9）wk。平均出生體重(BW)為1399±285(范圍610-2415)g。男嬰430例，占總的例數(shù)的59.0％。76例(10.4％)為小于胎齡兒(SGA)，199例(27.3％)為多胎。平均入NICU時(shí)齡為2.2±2.3(范圍0.3-24)小時(shí)。
　　 2.圍產(chǎn)期

6、特征
　　 544例(74.6％)極早產(chǎn)兒接受了規(guī)律產(chǎn)前檢查，141例(19.3％)產(chǎn)前檢查大于1次或情況不詳。199例(27.3％)應(yīng)用產(chǎn)前激素，362例(49.7％)剖宮產(chǎn)。153例(21.0％)胎膜早破＞24h，64例(8.8％)產(chǎn)前抗生素治療。461例(63.3％)的極早產(chǎn)兒母親存在明確妊娠期疾病，包括妊娠高血壓疾病160例(21.9％)、胎膜早破245例(33.6％)、前置胎盤(pán)或胎盤(pán)早剝72例(9.9％)、糖尿病72例

7、(9.9％)等。213例(29.2％)極早產(chǎn)兒中有的產(chǎn)房用氧復(fù)蘇史，其中103例(14.1％)極早產(chǎn)兒接受過(guò)氧氣或氣囊加壓給氧，110例(15.1％)極早產(chǎn)兒在產(chǎn)房接受了氣管插管，25例(3.4％)極早產(chǎn)兒接受了產(chǎn)房心臟按壓，14例(1.9％)極早產(chǎn)兒產(chǎn)房復(fù)蘇藥物。
　　 3.極早產(chǎn)兒NICU主要疾病構(gòu)成
　　 極早產(chǎn)兒主要疾病構(gòu)成與GA、BW成密切相關(guān)，胎齡、BW越小，患病比例越高。呼吸系統(tǒng)疾病是極早產(chǎn)兒最常見(jiàn)珍斷疾病

8、，主要包括:499例(68.4％)呼吸窘迫綜合癥(RDS)，353例(48.4％)新生兒肺炎，61例(8.4％)肺出血，55例(7.5％)新生兒持續(xù)性肺動(dòng)脈高壓(PPHN)，22例（3.0％，n=606例）支氣管肺發(fā)育不良(BPD)，16例(2.2％)氣胸等。其他常見(jiàn)疾病主要有動(dòng)脈導(dǎo)管未閉(PDA)462例(63.4％)，呼吸暫停287例(39.4％)，敗血癥92例(12.6％)，腦室內(nèi)出血(IVH)157例(21.5％)，腦室周?chē)踪|(zhì)

9、軟化(PVL)11例(1.5％)，壞死性小腸結(jié)腸炎(NEC)22例(3.0％)，3期以上早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病(ROP)11例(1.7％)等。
　　 4.呼吸系統(tǒng)疾病特征及臨床治療特點(diǎn)
　　 499例RDS極早產(chǎn)兒中，447例(89.6％)接受了肺表面活性物質(zhì)(PS)治療，66例(13.2％)接受了超過(guò)1次的PS治療。應(yīng)用PS與未使用PS相比，存活率無(wú)差異，但PS患兒GA較低、并發(fā)癥比例較高、MV和氧療時(shí)間較長(zhǎng);產(chǎn)房使用PS與N

10、ICU使用PS相比，兩者GA、存活率、并發(fā)癥、MV和氧療時(shí)間等均無(wú)顯著差異(P＞0.05);與牛源性PS相比，豬源性PS患兒GA、BW更低，住院時(shí)間更長(zhǎng)，存活率較低但無(wú)顯著差異（x2=2.625，P=0.105），主要并發(fā)癥、MV和氧療時(shí)間等均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　 RDS患兒499例(100％)接受機(jī)械通氣(MV)，其中79例(15.8％)只接受nCPAP，357例(71.5％)接受常頻機(jī)械通氣（CMV，不含HFO

11、V），63例(12.6％)接受HFOV。三種通氣方式中，HFOV存活率最低，MV時(shí)間最長(zhǎng)，相關(guān)疾病或并發(fā)癥比例最高（肺出血、氣胸、重度IVH）;與僅nCPAP相比，CMV除肺出血比例較高外，存活率或主要并發(fā)癥無(wú)差異。
　　 358例新生兒肺炎患兒中，57例(16.1％)痰培養(yǎng)陽(yáng)性，其中培養(yǎng)陽(yáng)性率較高的有:28例(49.1％)鮑曼不動(dòng)桿菌，18例(31.6％)肺炎克雷伯菌，6例(10.5％)大腸埃希菌和3例(7.0％)銅綠假單胞菌

12、。
　　 55例PPHN患兒中HFOV的比例為24例(43.6％)，吸入NO治療的比例為44例(80.0％)。PPHN與PDA密切相關(guān)，接受PDA結(jié)扎術(shù)患兒中患有PPHN的比例顯著高于非PPHN患兒(16.4％ vs1.9％,P＜0.001)。48例吸入NO的患兒中，8例(16.7％)需要接受PDA結(jié)扎術(shù)，占所有PDA結(jié)扎術(shù)患兒（22例）的36.4％。
　　 606例極早產(chǎn)兒糾正胎齡36wk治愈或好轉(zhuǎn)出院無(wú)氧依賴(lài)，22例

13、(3.6％)糾正胎齡36wk仍需氧療診斷為BPD。其中7例(31.8％)在生后28天接受激素治療，3例(13.6％)出科時(shí)需吸氧，19例(86.4％)治愈出院。
　　 5.其他常見(jiàn)疾病特征及臨床治療特點(diǎn)
　　 極早產(chǎn)兒入住NICU后根據(jù)病情需要至少進(jìn)行1次床旁頭顱超聲。157例(21.5％) IVH是超聲診斷比例最高的疾病，GA越小、BW越低，IVH比例越高。IVH在超早產(chǎn)兒比例為42.1％，VLBW比例為24.3％。<

14、br>　　 92例敗血癥極早產(chǎn)兒中，血培養(yǎng)陽(yáng)性70例(76.1％)。其中，肺炎克雷伯菌培養(yǎng)陽(yáng)性率最高37.1％（26例），其次為葡萄球菌30.0％（21例）、真菌12.9％(9例)、大腸埃希菌7.1％（5例）、鮑曼不動(dòng)桿菌5.7％（4例）等。
　　 22例NEC患兒中，只有7例(31.8％)接受手術(shù)治療，病死率為36.4％（8例）。死亡患兒中3例(37.5％)接受了手術(shù)治療，5例(62.5％)選擇了放棄治療。
　　 6

15、38例極早產(chǎn)兒在出院或死亡之前至少接受了1次眼底篩查，106例(16.6％)極早產(chǎn)兒有不同程度ROP表現(xiàn)，其中127例受檢超早產(chǎn)兒、410例受檢VLBW患兒的檢出比例分別為47.2％（60例）、23.4％（96例）。ROP患兒中11例(10.4％)接受了激光光凝手術(shù)治療。與未檢出ROP的存活極早產(chǎn)兒比較，ROP患兒的吸氧時(shí)間顯著延長(zhǎng)（中位數(shù):26天vs7天，P＜0.001）;與未接受手術(shù)治療的ROP超早產(chǎn)兒相比，接受ROP光凝術(shù)的超早產(chǎn)

16、兒氧療時(shí)間顯著較長(zhǎng)（中位數(shù):44天vs29天，P＜0.001）。
　　 極早產(chǎn)兒PDA比例按胎齡分層有顯著差異，GA越小，患病比例越高。462例PDA患兒中，380例(82.3％)接受了布洛芬治療，其中130例(34.2％)患兒接受布洛芬治療超過(guò)1個(gè)療程，GA越小，接受布洛芬治療療程越多。365例接受心臟超聲復(fù)查，205例(56.2％)患兒首個(gè)療程后PDA閉合，83例(22.7％)的患兒需接受多個(gè)療程后PDA閉合;GA越小，PD

17、A閉合的比例越低。22例(4.8％)PDA患兒在接受布洛芬治療后選擇PDA結(jié)扎術(shù);GA越小，PDA結(jié)扎術(shù)的比例越高。82例(17.7％) PDA未接受布洛芬治療，心臟超聲復(fù)查PDA自發(fā)性閉合的比例較布洛芬治療的比例高（90.2％ vs78.9％，P＜0.05），但布洛芬治療者GA和BW均較低、合并肺出血的比例較高、接受MV、氧療和住院時(shí)間較長(zhǎng)以及住院費(fèi)用較高，存活率無(wú)差異。接受多療程布洛芬治療的PDA患兒，GA較低，合并PPHN及吸入N

18、O治療的比例、PDA結(jié)扎術(shù)的比例均較高，接受MV、氧療和住院時(shí)間較長(zhǎng)以及住院費(fèi)用較高，但存活率與1個(gè)療程布洛芬PDA患兒相比無(wú)差異(92.8％vs94.6％, P=0.495)。
　　 6.極早產(chǎn)兒轉(zhuǎn)運(yùn)特點(diǎn)以及對(duì)極早產(chǎn)兒臨床轉(zhuǎn)歸的影響
　　 入選研究對(duì)象中，73例(10％)為本院出生新生兒(inborn)，656例(90％)為轉(zhuǎn)運(yùn)新生兒(outborn)。轉(zhuǎn)運(yùn)新生兒入院時(shí)齡為2.0小時(shí)（中位數(shù)），本院出生新生兒為0.5小

19、時(shí)（中位數(shù)），兩者有顯著性差異;GA、BW無(wú)差異(P＞0.05)。本院出生新生兒剖宮產(chǎn)、胎膜早破＞24小時(shí)比例高于轉(zhuǎn)運(yùn)新生兒，而后者多胎比例高于前者(x2=4.173，P=0.041)。轉(zhuǎn)運(yùn)新生兒產(chǎn)房搶救措施比例較本院出生新生兒高，但無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(x2=3.588，P=0.058)。573例(78.6％)極早產(chǎn)兒入NICU前轉(zhuǎn)運(yùn)中接受氧療。轉(zhuǎn)運(yùn)中氧療模式主要為面罩319例(55.7％)和氣管插管氣囊加壓人工呼吸240例(41.9％)

20、;氧療的比例與GA、BW密切相關(guān)，胎齡越小、BW越低，接受氧療比例越高(x2=124.7，P＜0.001)。
　　 對(duì)極早產(chǎn)兒入院后呼吸系統(tǒng)主要疾病、治療措施以及IVH比例比較，轉(zhuǎn)運(yùn)新生兒和本院出生新生兒無(wú)差異(P＞0.05)。治愈或好轉(zhuǎn)出院患兒中轉(zhuǎn)運(yùn)新生兒與本院出生新生兒的存活率無(wú)差異(91.3％ vs94.5％，P=0.384)，主要并發(fā)癥比例、MV、氧療和住院時(shí)間、住院費(fèi)用均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 對(duì)

21、入院極早產(chǎn)兒按入院時(shí)齡2小時(shí)（中位數(shù)）分層比較，入院時(shí)齡≤2h組GA、BW均無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。入院時(shí)齡≤2h患兒母親體外人工受精妊娠、妊娠高血壓疾病、規(guī)律產(chǎn)檢、產(chǎn)前激素治療和選擇剖宮產(chǎn)比例顯著高于入院時(shí)齡＞2h組，而后者生后窒息、產(chǎn)房有創(chuàng)性復(fù)蘇措施比例較高。入院時(shí)齡≤2h組患兒存活率高于入院時(shí)齡＞2h組(91.2％ vs84.8％，P＜0.05)，且放棄治療存活出院的比例顯著低于后者(11.2％vs21.7％，P＜0.01);存活者中主

22、要并發(fā)癥比例、MV、氧療時(shí)間和住院時(shí)間以及住院費(fèi)用等均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 7.死亡、存活者主要并發(fā)癥高危因素分析
　　 極早產(chǎn)兒NICU病死率為8.4％（61例），包括13例(1.8％)院內(nèi)死亡和48例(6.6％)放棄治療死亡。其中病死率超早產(chǎn)兒為21.3％（35例），VLBW為10.5％（50例），ELBW患兒為26.5％（18例）。GA、BW越低，病死率越高。57例(93.4％)患兒死于新生兒期。<

23、br>　　 多因素logistic回歸分析表明低GA、有創(chuàng)MV、入院時(shí)齡＞2h、合并氣胸、合并肺出血、未使用PS治療、嚴(yán)重先天畸形是極早產(chǎn)兒死亡的獨(dú)立高危因素。
　　 8.存活極早產(chǎn)兒住院時(shí)間和疾病負(fù)擔(dān)
　　 存活極早產(chǎn)兒住院時(shí)間為43天（中位數(shù)），住院費(fèi)用為46409元（中位數(shù)），住院費(fèi)用大約為同期北京市城市居民年收入的1.4倍。GA越小，住院時(shí)間越長(zhǎng)、疾病負(fù)擔(dān)越重。例如，住院時(shí)間（中位數(shù)）、住院費(fèi)用（中位數(shù)）GA≤

24、26 wk分別為92天、132771元，GA31wk分別為37天、38142元。
　　 9.放棄或姑息治療
　　 131例(18.0％)極早產(chǎn)兒家長(zhǎng)放棄或姑息治療，其中67例(51.1％)是由于不能支付繼續(xù)住院治療費(fèi)用，31例(23.7％)與患兒治療效果差有關(guān)，21例(16.0％)是由于伴有嚴(yán)重并發(fā)癥，12例(9.2％)是由于嚴(yán)重先天性疾病。患兒放棄治療后死于醫(yī)院的比例為36.6％（48例）。
　　 10.極早產(chǎn)

25、兒臨床特征與發(fā)達(dá)國(guó)家比較
　　 本研究中極早產(chǎn)兒產(chǎn)科干預(yù)比例與發(fā)達(dá)國(guó)家相比明顯較低，新生兒轉(zhuǎn)運(yùn)比例明顯高于發(fā)達(dá)國(guó)家，后者以產(chǎn)前轉(zhuǎn)運(yùn)為主。極早產(chǎn)兒總體存活率與發(fā)達(dá)國(guó)家水平相當(dāng)，但主要并發(fā)癥比例較發(fā)達(dá)國(guó)家低，分析可能與本院超早產(chǎn)兒的比例低、存活率較低有關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 1、本研究首次回顧性全面分析了國(guó)內(nèi)超大容量NICU極早產(chǎn)兒病例資料，開(kāi)創(chuàng)性的總結(jié)了國(guó)內(nèi)首個(gè)NICU亞專(zhuān)科監(jiān)護(hù)病房極早產(chǎn)兒的救治經(jīng)驗(yàn)。研究結(jié)果表

26、明極早產(chǎn)兒的救治水平，如89.5％的VLBW患兒治愈或好轉(zhuǎn)出院，與美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家同期NICU中VLBW患兒存活率90％相當(dāng)。
　　 2、本研究中極早產(chǎn)兒產(chǎn)科主動(dòng)于預(yù)比例（如產(chǎn)前激素應(yīng)用、剖腹產(chǎn)比例）明顯低于發(fā)達(dá)國(guó)家水平，而后者大量文獻(xiàn)研究表明極早產(chǎn)兒產(chǎn)前激素應(yīng)用可以顯著降低極早產(chǎn)兒的病死率和并發(fā)癥比例，因此我們可能在一定程度上延緩了極早產(chǎn)兒搶救時(shí)機(jī)，影響了極早產(chǎn)兒，特別是超早產(chǎn)兒在NICU中的轉(zhuǎn)歸。如我院超早產(chǎn)兒存活率為78.7

27、％，與美國(guó)(88％)等發(fā)達(dá)國(guó)家同期水平相比，仍然存在一定的差距。
　　 3、本院已成功建立了目前國(guó)內(nèi)最大的極早產(chǎn)兒轉(zhuǎn)運(yùn)中心，所收治極早產(chǎn)兒中，90％通過(guò)本院新生兒轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)由分娩醫(yī)院主動(dòng)轉(zhuǎn)入。眾所周知，極早產(chǎn)兒轉(zhuǎn)運(yùn)可能增加死亡和顱內(nèi)出血等并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)，但本研究結(jié)果表明轉(zhuǎn)運(yùn)新生兒和本院出生新生兒的存活率、主要并發(fā)癥比例無(wú)顯著差異，提示通過(guò)完善的轉(zhuǎn)運(yùn)網(wǎng)絡(luò)，短距離、2小時(shí)內(nèi)新生兒轉(zhuǎn)運(yùn)以及區(qū)域性大規(guī)模的Ⅲ級(jí)NICU救治可以將轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的不良事

28、件降至最低。
　　 4、極早產(chǎn)兒，特別是超早產(chǎn)兒的預(yù)后差風(fēng)險(xiǎn)高、疾病負(fù)擔(dān)重，患兒家長(zhǎng)救治意識(shí)（擔(dān)心預(yù)后）以及社會(huì)、家庭經(jīng)濟(jì)水平嚴(yán)重影響這些患兒的預(yù)后。
　　 第二部分人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞制備研究
　　 目的:
　　 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是干細(xì)胞家族的重要成員，具有高度增殖、自我更新能力，廣泛分布于骨髓、臍帶血、臍帶、胎盤(pán)等各種組織中。由于臍帶血來(lái)源豐富，采

29、集方便，排斥小，無(wú)倫理爭(zhēng)議等優(yōu)點(diǎn)，臍帶血來(lái)源MSCs作為新生兒嚴(yán)重疾病移植用種子細(xì)胞受到重視。然而，臍帶血(Umbilical Cord Blood，UCB) MSCs分離培養(yǎng)成功率低，目前對(duì)于如何從臍帶血中獲取MSCs仍存在爭(zhēng)議。本研究的目的:(1)研究UCB-MSCs其體外分離、純化及培養(yǎng)條件，并對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定，建立了穩(wěn)定的UCB-MSCs培養(yǎng)體系。(2)明確不同GA來(lái)源UCB-MSCs培養(yǎng)成功率是否有差異。
　　

30、 方法:
　　 (1)無(wú)菌條件下收集新鮮健康新生兒UCB，采用密度梯度離心法結(jié)合直接貼壁法體外分離UCB-MSCs，加入含體積分?jǐn)?shù)為10％人胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度為1×1011/L接種于胎牛血清包被過(guò)的塑料培養(yǎng)瓶中，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％的CO2飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞生長(zhǎng)到80％融合時(shí)，胰酶-EDTA混合液消化傳代。觀察貼壁細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，計(jì)算累積群體倍增水平，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)分析細(xì)

31、胞增殖活性、免疫表型，特異性染色方法鑒定細(xì)胞的多向分化潛能。(2)將UCB依GA分為3組:足月兒組(GA＞36周;n=16);早產(chǎn)兒組（GA32-36周;n=11）;極早產(chǎn)兒組（GA＜32周;n=9）。采耿相對(duì)適應(yīng)的條件培養(yǎng)，觀察能成功培養(yǎng)出MSCs的比率，探討GA、UCB采集量、UCB單核細(xì)胞(monocuclear cells，MNCs)數(shù)量對(duì)MSCs培養(yǎng)成功率的影響。
　　 結(jié)果:
　　 (1) UCB-單核細(xì)胞分

32、離接種4-5d后開(kāi)始可見(jiàn)有少量細(xì)胞貼壁，后貼壁細(xì)胞逐漸增多，并出現(xiàn)少量梭形和多角形細(xì)胞，2周后可見(jiàn)細(xì)胞形成集落，培養(yǎng)4-5周呈現(xiàn)融合。第2代細(xì)胞接種后24h內(nèi)開(kāi)始貼壁，2周左右即可達(dá)80％～90％融合。流式細(xì)胞儀細(xì)胞表面分子標(biāo)記檢測(cè)，此類(lèi)細(xì)胞穩(wěn)定地表達(dá)相關(guān)MSCs抗原標(biāo)記CD105、CD90、CD73和HLA-ABC，但不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD14、CD34和CD45。經(jīng)特殊培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)證實(shí)成功向軟骨、脂肪分化。傳代15代以

33、內(nèi)細(xì)胞數(shù)擴(kuò)增能力逐漸降低，第3代至第7代擴(kuò)增能力較明顯。流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡檢測(cè)表明細(xì)胞增殖力和生長(zhǎng)均良好。細(xì)胞反復(fù)凍存復(fù)蘇后細(xì)胞生物特性穩(wěn)定。
　　 (2) GA、UCB采集量、MNCs數(shù)量對(duì)UCB-MSCs培養(yǎng)成功與否的有顯著影響:①UCB-MSCs培養(yǎng)成功率為52.8％,成功者GA明顯小于未成功者（34.0±4.2vs36.8±3.3 wk; t=2.184，P=0.036），MSCs培養(yǎng)成功率隨GA增加呈降低趨勢(shì)

34、，差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=3.769，P=0.152)。②成功者采血量顯著高于未成功者（43.2±13.6 vs32.1±11.5ml; t=2.635，P=0.013）。成功者不同GA間UCB采血量有顯著差異(F=4.003，P=0.039)，GA越大，采血量越多。③成功培養(yǎng)MSCs的樣本單位體積內(nèi)MNCs數(shù)顯著高于未培養(yǎng)出MSCs的樣本(32.9±11.7 vs23.7±6.5×106/m1; t=2.863，P=0.008）;

35、成功者不同GA間 UCB單位體積內(nèi)MNCs數(shù)無(wú)顯著差異（F=1.087，P=0.361）。④按GA分層對(duì)MSCs產(chǎn)率比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三組間有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=13.309，P=0.000);GA越小，MSCs產(chǎn)率越高。
　　 結(jié)論:
　　 (1)本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)傳統(tǒng)方法的優(yōu)化，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)、細(xì)胞表明標(biāo)記分子以及體外分化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明我們成功分離UCB-MSCs，同時(shí)體外擴(kuò)增可以獲得豐量的UCB-MSCs，細(xì)胞經(jīng)凍存后復(fù)蘇