選擇性增殖腺病毒凈化造血干細胞與腫瘤細胞混合物的實驗研究.pdf

1、高劑量化療(HDC)聯(lián)合自體造血干細胞移植(AHSCT)是治療惡性淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤等血液系統(tǒng)惡性腫瘤的重要手段，其對乳腺癌等某些實體瘤的治療研究尚在評價中。最新研究資料顯示對于高危難治性乳腺癌，HDC聯(lián)合AHSCT可顯著提高患者的無病生存率及總生存率。自體造血干細胞移植物中污染腫瘤細胞回輸常常是導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)的原因。因此移植物的體外凈化是業(yè)內(nèi)研究的方向之一。免疫磁性細胞分選(MACS)富集CD34+細胞凈化技術(shù)，是目前臨床最廣泛應(yīng)用的

2、造血干細胞移植物凈化方法。但綜合資料顯示該方法僅可獲得2-5個對數(shù)級的腫瘤細胞去除，并未顯著延長患者的生存期。因此，尋求新的自體造血干細胞移植物凈化方法自然成為提高療效的研究方向。 基因治療載體系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)造血干細胞與惡性腫瘤細胞表面腺病毒受體存在天然差異，這種差異為靶向凈化造血干細胞移植物提供了新的選擇?；蚬こ谈脑斓倪x擇性增殖腺病毒，可以特異性地殺傷腫瘤細胞，H101便是其中的代表。本課題組己完成的研究顯示，乳腺癌細胞、多

3、發(fā)性骨髓瘤細胞表面腺病毒受體豐富，H101對其有較高轉(zhuǎn)染率；而造血干細胞卻基本不被腺病毒轉(zhuǎn)染。這啟發(fā)研究利用H101凈化自體造血干細胞移植物的可行性，并將其與目前最常用的MACS技術(shù)進行比較，以尋求自體造血干細胞移植物體外凈化的最佳方案。 凈化效果評價體系的建立是比較上述兩種凈化方法的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。首先我們在體外通過MTT比色法、集落形成法，研究了不同感染復(fù)數(shù)的H101對乳腺癌細胞、多發(fā)性骨髓瘤細胞以及造血干細胞的細胞毒作用。結(jié)果

4、發(fā)現(xiàn)在一定感染復(fù)數(shù)范圍內(nèi)，H101對腫瘤細胞的殺傷呈劑量效應(yīng)關(guān)系，200MOI可以完全殺滅腫瘤細胞；而該劑量對造血干細胞增殖能力基本沒有影響。繼之，建立了一套檢測自體造血干細胞移植物中的乳腺癌細胞及多發(fā)性骨髓瘤細胞的方法。將腫瘤細胞系列倍比稀釋后與動員后健康供者的外周血單個核細胞(PBMC)混合。對乳腺癌細胞與PBMC的混合物，應(yīng)用RT-PCR檢測上皮細胞角蛋白CK-19mRNA表達，107個PBMC中混有10個乳腺癌細胞即可檢出；應(yīng)用

5、腫瘤細胞集落形成實驗也可達到RT-PCR同樣的檢出效率。對于多發(fā)性骨髓瘤細胞與PBMC的混合物，通過流式細胞術(shù)檢測CD45-CDl38+細胞，以及免疫細胞化學(xué)法檢測λ型輕鏈表達，可以將102個腫瘤細胞從107個PBMC中檢測出來。 為了模擬臨床腫瘤患者自體造血干細胞移植物的凈化過程，在體外我們將腫瘤細胞與造血干細胞以1：100比例混合，分別以H101及MACS技術(shù)凈化，并用上述建立的腫瘤細胞檢測體系，評價兩種方案的凈化效率。結(jié)果

6、顯示對于乳腺癌細胞與造血干細胞的混合物，H101在200MOI感染復(fù)數(shù)、2小時的感染時間、1000[~1的感染體積下，應(yīng)用RT-PCR及集落形成法均未檢測到腫瘤細胞的存在；MACS技術(shù)也可達到相近的凈化效果。對于多發(fā)性骨髓瘤細胞與造血干細胞混合物的凈化顯示，H101及MACS技術(shù)也可達到相近的凈化效果。而以上兩種凈化方案對造血干細胞增殖能力均無明顯影響。 非肥胖糖尿?。瘒?yán)重聯(lián)合免疫缺陷鼠(NOD／SCID鼠)是進行造血干細胞凈化

7、評價的理想模型。在該品系小鼠體內(nèi)，對H101及MACS兩種凈化方法的凈化效率進行了系統(tǒng)的研究。在乳腺癌細胞清除效率方面，HE染色的肺、肝組織連續(xù)病理切片顯示，H101及MACS在合理的凈化條件下，均可顯著抑制NOD／SCID鼠肺內(nèi)成瘤；而未凈化組小鼠腫瘤細胞在肺內(nèi)形成多處癌巢。進一步以RT-PCR檢測小鼠肺組織中人源性CKl9mRNA表達，結(jié)果顯示，H101及MACS凈化組均未檢測到CKl9表達，而未凈化組可以檢測到特異性CKl9擴增。

8、在造血重建方面，以流式細胞術(shù)檢測骨髓中人源性免疫標(biāo)記的CD45+、CD45+CD34+、CD45+CDl9+、CD45+CD3+細胞，顯示在H101組、MACS組、未凈化組均獲得造血重建，并且人源性細胞的比例三組間沒有顯著差別。表明上述凈化手段對造血干細胞的造血重建能力沒有顯著影響。 本研究建立了理想的造血干細胞凈化效率評價體系；體外實驗結(jié)果顯示H101與MACS技術(shù)對乳腺癌細胞及多發(fā)性骨髓瘤細胞與造血干細胞的混合物，可獲得同樣