人原發(fā)性肝癌中IGF2-H19基因印記及其調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的：基因組印記（Genomic Imprinting）是指由于表遺傳學(xué)水平的修飾特意地沉默某一親代來源的等位基因，具有這種特征的基因稱為印記基因。人胰島素樣生長(zhǎng)因子2（Insulin-like growth factor 2, IGF2）和H19即為研究較早的一對(duì)相互毗鄰的印記基因。IGF2編碼的胰島素樣生長(zhǎng)因子-2是一種胚胎生長(zhǎng)因子及細(xì)胞有絲分裂原，在人體內(nèi)大多數(shù)組織中特異地表達(dá)父系來源的等位基因，而母源等位基因處于印記狀態(tài)。

2、H19表達(dá)一種功能尚不清楚的RNA，其印記狀態(tài)與IGF2相反，目前發(fā)現(xiàn)H19在正常組織內(nèi)均為母源等位基因表達(dá)，父源等位基因印記。印記基因表達(dá)異常包括印記丟失（Loss of imprinting, LOI）和印記獲得（Gain of imprinting, GOI），近年來大量的研究表明，印記異常是某些惡性腫瘤重要的分子生物學(xué)特征，這種表遺傳學(xué)改變可能是癌變機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)。幾乎所有的印記基因中都有一些區(qū)域在兩個(gè)不同親本來源的等位基因中

3、僅有一方是甲基化，這些序列被稱為“差異甲基化區(qū)域”（Differentially methylated regions, DMRs）或“印記控制區(qū)”（Imprinting control region, ICR）。針對(duì)小鼠的一系列刪失實(shí)驗(yàn)證明，H19上游的ICR可調(diào)控IGF2和H19的印記狀態(tài)；在人結(jié)腸癌、骨肉瘤等惡性腫瘤中也發(fā)現(xiàn)H19上游DMR（H19DMR）的甲基化狀態(tài)與IGF2和／或H19的印記異常有關(guān)。 原發(fā)性肝癌是嚴(yán)重

4、威脅人類健康的重要疾病之一，其發(fā)病率和死亡率均很高，尤其在亞洲和南非地區(qū)，但目前關(guān)于人肝癌中的印記狀態(tài)及調(diào)控機(jī)制的研究報(bào)道尚不多見。本課題擬通過同時(shí)檢測(cè)人原發(fā)性肝癌中IGF2和H19的印記改變及H19DMR的甲基化狀態(tài)，研究這三者與肝癌的關(guān)系；同時(shí)分析三者之間的相互關(guān)系，探討肝癌中H19DMR在IGF2/H19印記調(diào)控中的作用，從而為揭示IGF2和H19基因的印記調(diào)控機(jī)制積累更名的資料。 材料與方法：收集36例原發(fā)性肝癌患者手術(shù)

5、切除的肝癌組織和5例細(xì)胞株標(biāo)本（肝癌細(xì)胞株Bel-7402、SMMC-7721、HepG2、Huh-7，胚肝細(xì)胞株L-02），以7例健康人肝組織作為正常對(duì)照。利用IGF2第九外顯子內(nèi)有一單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)與ApaⅠ酶切位點(diǎn)重疊和H19第五外顯子內(nèi)有一單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)與RsaⅠ酶切位點(diǎn)重疊的特性，采用PCR-RFLP方法分析各個(gè)標(biāo)本的基因型，對(duì)IGF2或H19多態(tài)位點(diǎn)雜合的標(biāo)本，用RT-PCR-RFLP方法分析其印記狀態(tài)；同時(shí)用測(cè)序方法篩選

6、H19DMR內(nèi)3個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)雜和的標(biāo)本，并將其基因組DNA用亞硫酸氫鈉／氫醌修飾后擴(kuò)增出包含上述3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的H19DMR片斷，連入T-載體，克隆并測(cè)序，根據(jù)胞嘧啶是否被轉(zhuǎn)換為胸腺嘧啶分析各標(biāo)本中每條等位基因的甲基化狀態(tài)。 結(jié)果：48例待測(cè)標(biāo)本中，共篩出25例（7例正常肝，17例肝癌，1例細(xì)胞株）IGF2雜合標(biāo)本，14例（3例正常肝，11例肝癌）H19雜合標(biāo)本，25例（5例正常肝，20例肝癌）H19DMR雜合標(biāo)本。正常人肝

7、組織中，IGF2呈雙等位基因表達(dá)，H19呈單等位基因表達(dá)，H19DMR呈等位基因特異的差異甲基化狀態(tài)。多態(tài)位點(diǎn)雜合的肝癌組織標(biāo)本中，47.1％（8／17）檢測(cè)到IGF2的印記獲得，45.5％（5／11）檢測(cè)到H19的印記丟失，IGF2和H19的印記之間沒有明顯的相關(guān)性（P>0.05）。50.0％（10/20）的H19DMR雜合肝癌標(biāo)本中檢測(cè)到一種或多種H19DMR狀態(tài)異常，而且與IGF2/H19印記改變密切相關(guān)（P＜0.05）。其中20

8、.0％（4/20）檢測(cè)到H19DMR等位基因特異的低甲基化改變，但與IGF2的印記獲得無關(guān)（P>0.05），對(duì)H19的印記丟失也不是必要條件；35％（7/20）的肝癌標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)了H19DMR區(qū)域兩條等位基因數(shù)量失衡現(xiàn)象，而且H19DMR甲基化等位基因的減少或非甲基化等位基因的增加與IGF2 GOI相伴隨，而H19DMR非甲基化等位基因的減少或甲基化等位基因的增加與H19 LOI相伴隨。 結(jié)論：正常成人肝組織中IGF2為雙等位基因

9、表達(dá)，H19為單等位基因表達(dá)，H19DMR保持了差異甲基化狀態(tài)；IGF2的印記獲得與H19的印記丟失是人原發(fā)性肝癌中的頻發(fā)事件，但在肝癌中IGF2與H19的等位基因表達(dá)呈相對(duì)獨(dú)立性；人原發(fā)性肝癌中H19DMR等位基因特異的異常低甲基化比其異常高甲基化更常見；人原發(fā)性肝癌中H19DMR的異常甲基化狀態(tài)與IGF2和H19的印記改變密切相關(guān)，但不是充分條件，提示在人原發(fā)性肝癌中，除了H19DMR第六CTCF結(jié)合位點(diǎn)附近區(qū)域甲基化狀態(tài)的改變，可