硝化對(duì)胰島素結(jié)構(gòu)、功能影響的研究.pdf

1、糖尿病是一種常見(jiàn)的易發(fā)性代謝疾病。越來(lái)越多的證據(jù)表明，活性氧和活性氮介導(dǎo)糖尿病及其并發(fā)癥的病理過(guò)程。蛋白質(zhì)酪氨酸硝化是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，它與炎癥、心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病等多種病癥相關(guān)。過(guò)氧亞硝酸根(ONOO-)路徑是促使蛋白質(zhì)硝化最主要的一種途徑，其反應(yīng)為自由基機(jī)理。與糖尿病相關(guān)的蛋白質(zhì)硝化已有較多文獻(xiàn)報(bào)道，這不僅表現(xiàn)在硝基酪氨酸(NT)水平的增高，也有特定的硝化蛋白被發(fā)現(xiàn)。胰島素是由脊椎動(dòng)物胰腺β細(xì)胞分泌的一種多功能蛋白

2、質(zhì)激素，是治療糖尿病最有效的藥物。ONOO-可能會(huì)在β細(xì)胞內(nèi)形成，對(duì)細(xì)胞造成損傷，而胰島素也可能成為氧化應(yīng)激條件下ONOO-的一個(gè)靶點(diǎn)。目前有關(guān)ONOO-對(duì)胰島素及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)影響的報(bào)道還較少。 本文研究了體外ONOO-對(duì)胰島素的硝化反應(yīng)，探討了硝化對(duì)胰島素結(jié)構(gòu)、功能的影響，并對(duì)抗氧化劑等因素對(duì)胰島素硝化作用的影響進(jìn)行了研究，取得了以下主要結(jié)果： ⑴采用紫外可見(jiàn)光譜、凝膠電泳、免疫印跡以及質(zhì)譜等對(duì)胰島素的硝化產(chǎn)物進(jìn)行了

3、表征，并考察了pH 值、CO2、鐵配合物等因素以及白蛋白對(duì)該反應(yīng)的影響。 結(jié)果顯示ONOO-可以硝化胰島素酪氨酸(Tyr)殘基，且隨濃度的不斷增大，胰島素4個(gè)酪氨酸殘基都有可能被硝化。ONOO-硝化胰島素的反應(yīng)與pH 值密切相關(guān)，在生理pH 值條件下，ONOO-的硝化作用最強(qiáng)。CO2 對(duì)胰島素的硝化具有催化作用。乙二胺四乙酸鐵配合物可催化胰島素硝化，而二乙三胺五乙酸鐵配合物對(duì)胰島素硝化無(wú)影響。白蛋白對(duì)胰島素的硝化具有競(jìng)爭(zhēng)抑制作用

4、，但在高濃度的白蛋白存在時(shí)，胰島素依然可以被硝化。 ⑵采用高效液相色譜分離制備得到了胰島素的單硝化和二硝化組分。運(yùn)用凝膠電泳、高效液相色譜和質(zhì)譜等技術(shù)，結(jié)合A、B 鏈拆分和V8 蛋白酶酶解方法，對(duì)硝化胰島素的硝化位點(diǎn)進(jìn)行了分析。還原條件下硝化組分的常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳以及色譜分離出的單硝化胰島素A 鏈的質(zhì)譜結(jié)果表明胰島素的A 鏈優(yōu)先B 鏈被硝化。V8 蛋白酶酶切單硝化胰島素后的質(zhì)譜結(jié)果表明單硝化胰島素的硝化位點(diǎn)是Tyr-A14

5、。結(jié)合電泳的結(jié)果和晶體結(jié)構(gòu)分析，Tyr-A19 較B 鏈上的Tyr 殘基更容易硝化，而Tyr-B26 可能較Tyr-B16 更容易硝化。 ⑶運(yùn)用光譜學(xué)方法研究了硝化對(duì)胰島素二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。綜合熒光光譜、圓二色光譜和傅立葉變換紅外光譜的測(cè)試結(jié)果，發(fā)現(xiàn)單硝化和二硝化胰島素與胰島素相比α-螺旋的含量下降，A 鏈的硝化可能使A(12-17)的310 螺旋肽段逐漸向不規(guī)則螺旋和無(wú)規(guī)結(jié)構(gòu)方向變化，但對(duì)胰島素與受體結(jié)合面的影響不大。同時(shí)硝基的

6、引入使得單硝化和二硝化硝化胰島素趨向于聚集，而二硝化胰島素中Tyr-A19 的硝化可能會(huì)改變胰島素與受體的結(jié)合面疏水區(qū)的疏水性質(zhì)。 采用循環(huán)伏安法研究了Tyr、NT 以及Tyr、NT 與白蛋白相互作用后的伏安行為，結(jié)果表明硝基的引入將會(huì)改變酚羥基氫鍵的作用方式，影響Tyr 與白蛋白的相互作用，這從一個(gè)側(cè)面反映了硝化可能會(huì)影響胰島素與受體的結(jié)合。 ⑷測(cè)定了單硝化胰島素的生物活力，并對(duì)硝化胰島素刺激胰島素受體磷酸化進(jìn)行了初步

7、的討論。單硝化胰島素的受體結(jié)合能力約為胰島素的70％，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與此結(jié)果相一致。 ⑸采用紫外可見(jiàn)光譜測(cè)定胰島素與ONOO-反應(yīng)后NT 產(chǎn)量的變化，研究了谷胱甘肽(GSH)和Ebselen 等抗氧化劑對(duì)ONOO-硝化胰島素的影響，并采用高效液相色譜和質(zhì)譜等手段對(duì)GSH 和Ebselen 之間相互作用及其對(duì)ONOO-硝化胰島素的影響機(jī)理進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，油酸和花生四烯酸對(duì)胰島素的硝化具有很強(qiáng)的抑制作用，不飽和脂肪酸的抑制作用隨其不