IGF1Rα的真核表達(dá)及其對肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞株免疫治療作用的體外研究.pdf

1、背景與目的：原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌是一種常見的惡性腫瘤，適合手術(shù)治療的患者只占一少部分，具有較高的復(fù)發(fā)率，預(yù)后很差，嚴(yán)重威脅著人類的健康。人類腫瘤相關(guān)性抗原以及腫瘤抗原基因的發(fā)現(xiàn)，為腫瘤的免疫治療尤其是主動性免疫治療提供了新的手段。直接作用于腫瘤特異性抗原或相關(guān)抗原的預(yù)防性瘤苗是目前研究的熱點(diǎn)。胰島素樣生長因子Ⅰ受體（IGF1R）在各種腫瘤細(xì)胞中高水平表達(dá)，尤其是在肝癌細(xì)胞，而在正常的肝細(xì)胞則低表達(dá)。因此，制備IGF1R特異性瘤苗，可作為肝癌

2、治療的一種新思路。 樹突狀細(xì)胞（DC）是體內(nèi)功能強(qiáng)大的專職性抗原提呈細(xì)胞，它能夠高效地?cái)z取、處理抗原，并將處理后的多肽呈遞給靜息型T細(xì)胞，引起針對該抗原的特異性免疫反應(yīng)。DC應(yīng)用于腫瘤免疫洽療是目前的研究熱點(diǎn)，許多研究證實(shí)，腫瘤患者樹突狀細(xì)胞的質(zhì)量及功能均減弱，MHC分子和共刺激分子CD80、CD86的表達(dá)量下降。因此，體外誘導(dǎo)功能正常的樹突狀細(xì)胞，經(jīng)修飾的腫瘤相關(guān)性抗原或特異性抗原，作為疫苗免疫腫瘤患者，是腫瘤治療的一個(gè)發(fā)展方

3、向。制備DC瘤苗的方法有腫瘤特異性或相關(guān)性抗原、腫瘤細(xì)胞裂解物與DC共培養(yǎng)，腫瘤細(xì)胞與DC融合、腫瘤細(xì)胞總mRNA轉(zhuǎn)染DC等。相關(guān)性抗原與DC共孵是常用的方法。 本研究擬構(gòu)建IGF1RαcDNA真核表達(dá)載體，體外表達(dá)IGF1Rα蛋白片段，與DC細(xì)胞共孵，誘導(dǎo)針對表達(dá)IGF1R的HepG2特異性免疫反應(yīng)，尋找新的治療肝癌的途徑，并初步探討肝癌相關(guān)性抗原IGF1R作為肝癌靶向治療的可行性。 方法：1．提取HepG2的RNA，

4、RT-PCR擴(kuò)增IGFIRα蛋白片段序列，PCR產(chǎn)物與pGEM-Teasy載體的連接，經(jīng)過擴(kuò)增測序確證后，利用pcDNA3/HA載體構(gòu)建了IGFIRα段編碼區(qū)與載體HA的融合真核表達(dá)重組子，并在HEK293細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，轉(zhuǎn)染72小時(shí)通過Western印跡檢測2．取健康供者外周血單個(gè)核細(xì)胞，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，貼壁法進(jìn)一步純化細(xì)胞，收集非貼壁細(xì)胞（淋巴細(xì)胞）。貼壁細(xì)胞在細(xì)胞因子rhGM-CSF（1000 u/m

5、l），rhIL-4（100 ng/ml）作用下，體外誘導(dǎo)DC。收集培養(yǎng)4d的DC，將IGF1Rα蛋白加入DC中，另設(shè)不加抗原對照組和無關(guān)抗原對照組，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測表型，收集各組DC，與淋巴細(xì)胞按5：1比例混合接種于6孔板，培養(yǎng)7d，收集的細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞。選擇表達(dá)IGF1R肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞作為靶細(xì)胞，按效靶比20：1、10：1混合接種培養(yǎng)48h，同時(shí)設(shè)單一靶細(xì)胞組、單一效應(yīng)細(xì)胞組。以MTT法檢測效應(yīng)細(xì)胞對

6、靶細(xì)胞的殺傷率。 結(jié)果：1．成功構(gòu)建了IGF1α-pGEMT重組載體，測序后經(jīng)NCBI同源性比較，結(jié)果與IGF1R mRNA（NM000875）一致。進(jìn)一步構(gòu)建IGFlRα-pcDNA3/HA融合真核表達(dá)載體，用EcoRI/XhoI雙酶切確定。轉(zhuǎn)染HEK293蛋白表達(dá)，經(jīng)Western檢測，可檢測到分子量約為34KD的蛋白條帶，與預(yù)期的蛋白分子量一致。2．誘導(dǎo)的DC光鏡下，細(xì)胞周圍可見毛刺狀突起和樹枝狀突起，IGF1Rα蛋白刺激

7、的DC比未經(jīng)抗原刺激的DC的CD86、CD83、CD80、CD40都有所升高，表達(dá)量分別為87．9％，69．7％，88．69％，90．1％；而CD14水平下降，表達(dá)量僅為11．8％。說明IGFlRα蛋白刺激的DC比未經(jīng)抗原刺激的DC進(jìn)一步成熟。MTT檢測對照組為未經(jīng)致敏的DC細(xì)胞激活的T細(xì)胞，空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染得到的蛋白致敏的DC細(xì)胞激活的T細(xì)胞，試驗(yàn)組為目的基因真核轉(zhuǎn)染得到的目的蛋白致敏的DC細(xì)胞激活的T細(xì)胞，試驗(yàn)組與對照組比有明顯的殺傷He

8、pG2細(xì)胞的作用（P<0．05），其活化的CTL對表達(dá)IGF1R的肝癌細(xì)胞株HepG2在效靶比為20．1時(shí)殺傷率為30．1％。對照組之間沒有明顯差異。在20：1和10：1情況下，目的蛋白致敏的DC細(xì)胞激活的T淋巴細(xì)胞對HepG2細(xì)胞與NIH3T3細(xì)胞的殺傷作用有明顯的差異（P<0．05）。 結(jié)論：我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)構(gòu)建表達(dá)的IGF1Rα蛋白片段具有良好的免疫原性，可以刺激DC細(xì)胞進(jìn)一步成熟，致敏的DC可有效誘導(dǎo)CTL克隆的生成。提示