胚肝細胞誘導肝癌細胞株HepG2再分化中調控環(huán)路的重建.pdf

1、目的：
　　全球癌癥數(shù)據(jù)顯示，肝癌發(fā)病率是世界所有惡性腫瘤的第5位，每年約有70萬人死于肝癌。我國是全球肝癌發(fā)病率最高的國家，肝癌發(fā)病人數(shù)超過全球發(fā)病人數(shù)的50％，其中90%以上為肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)。然而，目前對于HCC的治療存在著切除率低、肝源有限、毒副作用大、復發(fā)率高等問題，即使在發(fā)達國家，5年的相對生存率不到15%，嚴重威脅著人類生命健康。因此，闡明HCC的發(fā)病機制，尋求有

2、效根除HCC的方法，成為生命科學界和醫(yī)學界的重點和難點。
　　早在20世紀70年代，Pierce等人提出了腫瘤是一個發(fā)育生物學問題的理論。更多的研究證實，早期胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生在許多方面存在著驚人的相似性，如早期胚胎細胞的分化和增殖機制與腫瘤細胞的分化和增殖機制；早期胚胎植入與腫瘤的侵襲性轉移；兩者的免疫逃避機制等。Misirlioglu等證實腫瘤細胞有胚胎性基因的表達，如甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)、癌

3、胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)和胰胚抗原(pancreatic oncotetal antigen,POA)等；繼而，Dvorak等研究發(fā)現(xiàn)胚胎植入子宮內膜的過程也有大量腫瘤形成過程中癌基因的表達。Hochedlinger等也同樣證實了胚胎微環(huán)境可能存在調控腫瘤細胞向特定細胞分化并改變其惡性表型的機制。據(jù)此，導師齊錦生教授提出，胚胎細胞誘導腫瘤細胞的再分化具有組織和時間特異性，用特定發(fā)育階段的胚肝細胞

4、與肝癌細胞HepG2共培養(yǎng)，可誘導肝癌細胞HepG2的再分化，且已經實驗證實，本實驗旨在此基礎上進一步探討誘導分化過程中的主要分子機制。
　　Young等人發(fā)現(xiàn)肝細胞中，HNF4α、HNF1α、HNF6和USF1之間通過相互調節(jié)及自我調節(jié)作用形成了高度關聯(lián)的核心轉錄調控環(huán)路。相關研究也發(fā)現(xiàn)，肝富集轉錄因子(Liver enriched transcription factors,LETFs)包括C/EBP、DBP、HNF3、HNF

5、1、HNF4、HNF6在胚肝的發(fā)育和分化過程中起著至關重要的作用。HNF4α是調節(jié)肝細胞分化和功能特異性的關鍵因子，其表達維持著肝正常的分化狀態(tài)和功能，表達缺失則會刺激肝細胞增殖導致HCC。因此，HNF4α可看作HCC的抑癌基因，可能成為治療HCC的一個新靶點。
　　本實驗小組前期試驗證明，13.5天和14.5天的胚肝細胞與肝癌細胞HepG2細胞共培養(yǎng)48h后，HepG2細胞生長明顯抑制，且部分細胞回縮、變圓，最終崩解；HepG2

6、細胞中分化標志HNF4α、HNF1α、HNF6和USF1在轉錄水平和蛋白水平均上調，原癌基因 c-Myc在轉錄水平和蛋白水平均下調；HepG2細胞中AFP蛋白含量明顯下降。說明胚肝細胞可誘導肝癌細胞的再分化，且具有組織和時間特異性。然而，肝癌細胞 HepG2再分化過程是否是重建了 HepG2細胞中 HNF4α、HNF1α、HNF6和 USF1的核心調控環(huán)路；HNF4α是否是此調控環(huán)路的核心因子；仍需進一步的實驗證明。
　　本實驗旨

7、在在前期實驗結果的基礎上，進一步揭示胚肝細胞誘導肝癌細胞再分化的主要分子機制。首先用13.5d的胚肝細胞與肝癌細胞HepG2共培養(yǎng)48h后，利用染色質免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)技術，檢測HepG2細胞中HNF4α、HNF1α、HNF6和USF1的核心調控環(huán)路的重新建立。在轉染siRNA-HNF4α(si-HNF4α)，敲低HepG2細胞中 HNF4α的表達，檢測共培養(yǎng)后，HepG2

8、細胞中HNF4α、HNF1α、HNF6和USF1轉錄水平和蛋白水平的變化，進一步證明HNF4α、HNF1α、HNF6和USF1之間的相互調控作用；利用免疫熒光法檢測HepG2細胞中AFP的表達變化；探明了阻斷HNF4α、HNF1α、HNF6和USF1之間的調控環(huán)路后，對胚肝細胞誘導肝癌細胞的再分化過程的影響。據(jù)此，探討胚肝細胞誘導肝癌細胞再分化的主要分子機制，為治療HCC提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1.細胞的培養(yǎng)

9、　　HepG2細胞: HepG2細胞用含1%非必需氨基酸和10%新生牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，0.25%的胰蛋白酶消化傳代，接種于100ml培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　原代胚肝細胞分離及培養(yǎng)：采用Ⅳ膠原酶消化法，從孕鼠腹中取得胎鼠，分離出胚肝，將胚肝組織剪成組織塊，Ⅳ膠原酶消化胚肝組織塊，成功分離為單個胚肝細胞；多次重復差速貼壁法除去成纖維細胞，純化胚肝細胞；高糖DMEM培養(yǎng)胚肝細胞。
　　2.實

10、驗設計與分組：
　　(1)誘導HepG2細胞再分化的過程中，檢測HNF4α、HNF1α、HNF6和USF1之間的相互調節(jié)作用，實驗分成2組：untreated組(單純HepG2細胞)；co-culture組(HepG2細胞與13.5d的胚肝細胞共培養(yǎng)48h)。
　　(2)用Lipofectamine2000(Lipo2000)將FAM-siRNA轉入HepG2細胞中，轉染效率的評價，實驗分成2組：轉染試劑對照(Mock)組；

11、FAM-siRNA組。
　　(3)HepG2細胞中轉染si-GAPDH，計算陽性對照的抑制率，實驗分成2組：Mock組；si-GAPDH組。
　　(4)HepG2細胞轉染si-HNF4α，不同靶點si-HNF4α的抑制率，按照同一siRNA(pmol)與Lipo2000(μl)比例(1:0.05)，不同靶點分成5組：Mock組；陰性對照(si-NC)組；si-HNF4α-273(si-T1)組；si-HNF4α-297(si

12、-T2)組；si-HNF4α-699(si-T3)組。
　　(5)HepG2細胞中轉染 si-HNF4α，不同濃度 si-HNF4α的抑制率，按照同一靶點(HNF4α-273)，不同siRNA(pmol)與Lipo2000(μl)比例，分成5組：Mock組；si-NC組；1:0.04組；1:0.05組；1:0.06組。
　　(6)HepG2細胞轉染si-HNF4α24h后，再與13.5d的胚肝細胞共培養(yǎng)48h，實驗分成4組：

13、untreated組(單純 HepG2細胞)；co-culture組；co-culture+si-NC組；co-culture+si-HNF4α組。
　　3.胚肝細胞誘導肝癌細胞HepG2再分化的過程中，HepG2細胞中HNF4α、HNF1α、HNF6和USF1相互調節(jié)作用的檢測
　　收集細胞，ChIP技術檢測HepG2細胞中HNF4α、HNF1α、HNF6和USF1之間的相互調節(jié)作用。
　　4.HepG2細胞轉染si

14、RNA，轉染效率、si-GAPDH抑制率和si-HNF4α抑制率的計算
　　利用熒光顯微鏡和流式細胞術計算轉染效率。
　　Trizol一步法提取HepG2細胞中總RNA，用β-actin做內參，Real-time PCR方法檢測GAPDH和HNF4α的mRNA表達，計算GAPDH和HNF4α的抑制率。
　　5.肝癌細胞HepG2轉染si-HNF4α后，再與13.5d的胚肝細胞共培養(yǎng)48h，HepG2細胞中HNF4α、H

15、NF1α、HNF6、USF1和c-Myc轉錄水平的檢測
　　Trizol一步法分別提取 HepG2細胞中總 RNA；用β-actin做內參， Real-time PCR方法檢測HNF4α、HNF1α、HNF6、USF1和c-Myc的mRNA表達。
　　6.肝癌細胞HepG2轉染si-HNF4α后，再與13.5d的胚肝細胞共培養(yǎng)48h，HepG2細胞中HNF4α、HNF1α、HNF6和USF1蛋白水平的檢測
　　RIPA

16、裂解法分別提取HepG2細胞中總蛋白，Lowry法測定蛋白含量，Western-blotting檢測HepG2細胞中HNF4α、HNF1α和USF1的蛋白含量。
　　7.肝癌細胞HepG2轉染si-HNF4α后，再與13.5d的胚肝細胞共培養(yǎng)48h，HepG2細胞中AFP蛋白含量的檢測
　　利用免疫熒光法檢測，HepG2細胞中AFP的表達量。
　　結果：
　　1.原代胚肝細胞的分離純化及培養(yǎng)
　　采用Ⅳ型膠

17、原酶消化法，首先將胚肝組織剪成組織塊，Ⅳ膠原酶消化胚肝組織塊，成功分離為單個胚肝細胞；多次重復差速貼壁法除去成纖維細胞，純化胚肝細胞；高糖DMEM培養(yǎng)胚肝細胞，利用免疫熒光法檢測胚肝細胞中表達胚肝細胞特異蛋白AFP，提示原代胚肝細胞培養(yǎng)成功。2 ChIP技術檢測與13.5d的胚肝細胞共培養(yǎng)48h后，HepG2細胞內HNF4α、HNF1α、HNF6和USF1相互調節(jié)作用的變化
　　2.1.HepG2細胞與13.5d的胚肝細胞共培養(yǎng)4

18、8h后，HepG2細胞內HNF4α在HNF1α的啟動子區(qū)的結合作用(6.366±0.099, P<0.05)與untreated組相比顯著升高；
　　2.2.HepG2細胞與13.5d的胚肝細胞共培養(yǎng)48h后，HepG2細胞內HNF4α在USF1的啟動子區(qū)的近端的結合作用(28.485±1.080, P<0.05)與untreated組相比顯著升高；
　　2.3.HepG2細胞與13.5d的胚肝細胞共培養(yǎng)48h后，HepG2

19、細胞內HNF4α在USF1的啟動子區(qū)的遠端的結合作用(19.924±0.622, P<0.05)與untreated組相比顯著升高；
　　2.4.HepG2細胞與13.5d的胚肝細胞共培養(yǎng)48h后，HepG2細胞內USF1在HNF6的啟動子區(qū)的結合作用(5.606±0.475, P<0.05)與untreated組相比顯著升高；
　　2.5.HepG2細胞與13.5d的胚肝細胞共培養(yǎng)48h后，HepG2細胞內HNF6在HNF

20、4α的啟動子區(qū)近端的結合作用(2.445±0.181, P<0.05)與untreated組相比顯著升高；
　　2.6.HepG2細胞與13.5d的胚肝細胞共培養(yǎng)48h后，HepG2細胞內HNF6在HNF4α的啟動子區(qū)遠端的結合作用(2.767±0.187, P<0.05)與untreated組相比顯著升高；
　　2.7.HepG2細胞與13.5d的胚肝細胞共培養(yǎng)48h后，HepG2細胞內HNF1α在HNF4α的啟動子區(qū)的結

21、合作用(2.623±0.079, P<0.05)與untreated組相比顯著升高。
　　3.HepG2細胞中轉染si-HNF4α，敲低HepG2細胞中HNF4α的表達后，再與13.5d的胚肝細胞共培養(yǎng)48h，檢測HepG2細胞中HNF4α、HNF1α、HNF6、USF1和c-Myc轉錄水平的變化
　　3.1.HepG2細胞中轉染FAM-siRNA，用熒光顯微鏡及流式細胞術計算轉染效率>90%；
　　3.2.HepG2

22、細胞中轉染si-GAPDH，HepG2細胞中GAPDH的相對表達量(0.437±0.022, P<0.01)，與Mock組相比明顯下降；
　　3.3.HepG2細胞中轉染不同靶點的si-HNF4α，HepG2細胞中HNF4αmRNA的相對表達量與Mock組相比，si-NC組(1.057±0.030,P>0.05)無明顯變化，si-T1組(0.366±0.022,P<0.01)，si-T2組(0.552±0.037,P<0.01)，

23、si-T3組(0.692±0.027,P<0.01)，均明顯下降；
　　3.4.HepG2細胞中轉染不同濃度的si-HNF4α，HepG2細胞中HNF4αmRNA的相對表達量與Mock組相比，si-NC組(1.063±0.040,P>0.05)無明顯變化，1:0.04組(0.318±0.033,P<0.01)，1:0.05組(0.391±0.035,P<0.01)，1:0.06組(0.514±0.021,P<0.01)，均明顯下降

24、；
　　3.5 HepG2細胞轉染si-HNF4α24h后，再與13.5d的胚肝細胞共培養(yǎng)48h， HepG2細胞中HNF4α mRNA的相對表達量co-culture組與 untreated組(0.481±0.015, P<0.01)相比，co-culture組明顯升高；HepG2細胞中HNF4αmRNA的相對表達量與co-culture組相比，co-culture+si-NC組(1.029±0.093,P>0.05)無明顯變化

25、，co-culture+si-HNF4α組(0.319±0.008,P<0.05)明顯下降；
　　3.6.HepG2細胞轉染si-HNF4α24h后，再與13.5d的胚肝細胞共培養(yǎng)48h，HepG2細胞中 HNF1αmRNA的相對表達量co-culture組與 untreated組(0.252±0.049,P<0.01)相比，co-culture組明顯升高；HepG2細胞中HNF1αmRNA的相對表達量與co-culture組相比

26、，co-culture+si-NC組(0.980±0.063,P>0.05)無明顯變化，co-culture+si-HNF4α組(0.203±0.039,P<0.05)明顯下降；
　　3.7.HepG2細胞轉染si-HNF4α24h后，再與13.5d的胚肝細胞共培養(yǎng)48h，HepG2細胞中HNF6 mRNA的相對表達量co-culture組與 untreated組(0.365±0.010,P<0.01)相比，co-culture組

27、明顯升高；HepG2細胞中HNF6 mRNA的相對表達量與co-culture組相比，co-culture+si-NC組(0.933±0.062,P>0.05)無明顯變化，co-culture+si-HNF4α組(0.286±0.019,P<0.05)明顯下降；
　　3.8.HepG2細胞轉染si-HNF4α24h后，再與13.5d的胚肝細胞共培養(yǎng)48h，HepG2細胞中USF1 mRNA的相對表達量co-culture組與 un

28、treated組(0.529±0.038, P<0.01)相比，co-culture組明顯升高；HepG2細胞中 USF1 mRNA的相對表達量與co-culture組相比，co-culture+si-NC組(0.974±0.058,P>0.05)無明顯變化，co-culture+si-HNF4α組(0.429±0.003,P<0.05)明顯下降；
　　3.9.HepG2細胞轉染si-HNF4α24h后，再與13.5d的胚肝細胞共

29、培養(yǎng)48h，HepG2細胞中c-Myc mRNA的相對表達量co-culture組與 untreated組(2.133±0.173,P<0.05)相比，co-culture組明顯降低；HepG2細胞中c-Myc mRNA的相對表達量與co-culture組相比，co-culture+si-NC組(1.104±0.074,P>0.05)無明顯變化，co-culture+si-HNF4α組(1.622±0.178,P<0.05)明顯升高。<

30、br>　　4.HepG2細胞中轉染si-HNF4α，敲低HepG2細胞中HNF4α的表達后，再與13.5d的胚肝細胞共培養(yǎng)48h，檢測共培養(yǎng)后，HepG2細胞中HNF4α、HNF1α、HNF6、USF1和c-Myc蛋白水平的變化
　　4.1.HepG2細胞轉染si-HNF4α24h后，再與13.5d的胚肝細胞共培養(yǎng)48h，HepG2細胞中 HNF4α蛋白的相對表達量與 untreated組(0.440±0.017, P<0.01)

31、相比，co-culture組(1.920±0.052)明顯升高；HepG2細胞中HNF4α蛋白的相對表達量與co-culture組相比，co-culture+si-NC組(1.857±0.016,P>0.05)無明顯變化，co-culture+si-HNF4α組(0.971±0.015, P<0.01)明顯下降；
　　4.2.HepG2細胞轉染si-HNF4α24h后，再與13.5d的胚肝細胞共培養(yǎng)48h， HepG2細胞中HNF

32、1α蛋白的相對表達量與 untreated組(1.168±0.050,P<0.01)相比，co-culture組(1.750±0.056)明顯升高；HepG2細胞中HNF1α蛋白的相對表達量與co-culture組相比，co-culture+si-NC組(2.005±0.069,P>0.05)無明顯變化，co-culture+si-HNF4α組(0.558±0.017,P<0.01)明顯下降；
　　4.3.HepG2細胞轉染si-

33、HNF4α24h后，再與13.5d的胚肝細胞共培養(yǎng)48h，HepG2細胞中HNF6蛋白的相對表達量與untreated組(0.615±0.032,P<0.01)相比，co-culture組(1.004±0.068)明顯升高；HepG2細胞中 HNF6蛋白的相對表達量與co-culture組相比，co-culture+si-NC組(1.008±0.065,P>0.05)無明顯變化，co-culture+si-HNF4α組(0.677±0.

34、049,P<0.05)明顯下降；
　　4.4.HepG2細胞轉染si-HNF4α24h后，再與13.5d的胚肝細胞共培養(yǎng)48h，HepG2細胞中USF1蛋白的相對表達量與untreated組(0.688±0.023,P<0.01)相比，co-culture組(1.293±0.033)明顯升高；HepG2細胞中USF1蛋白的相對表達量與 co-culture組相比，co-culture+si-NC組(1.219±0.043,P>0.

35、05)無明顯變化，co-culture+si-HNF4α組(0.659±0.018,P<0.01)明顯下降；
　　4.5.HepG2細胞轉染si-HNF4α24h后，再與13.5d的胚肝細胞共培養(yǎng)48h，HepG2細胞中c-Myc蛋白的相對表達量與 untreated組(0.344±0.013,P<0.01)相比，co-culture組(0.210±0.014)明顯下降；HepG2細胞中c-Myc蛋白的相對表達量與co-cultu

36、re組相比，co-culture+si-NC組(0.531±0.037,P<0.01)和co-culture+si-HNF4α組(0.317±0.016,P<0.05)都明顯升高。
　　5.HepG2細胞中轉染si-HNF4α，敲低HepG2細胞中HNF4α的表達后，再與13.5d的胚肝細胞共培養(yǎng)48h，免疫熒光檢測HepG2細胞中AFP蛋白水平的變化
　　HepG2細胞轉染si-HNF4α24h后，再與13.5d的胚肝細胞

37、共培養(yǎng)48h后，免疫熒光法檢測HepG2細胞中AFP蛋白的相對表達量與untreated組相比，co-culture組明顯降低；HepG2細胞中 AFP蛋白的相對表達量與co-culture組相比，co-culture+si-NC組無明顯變化，co-culture+si-HNF4α組明顯升高。
　　結論：
　　本實驗揭示：小鼠胚肝細胞誘導人肝癌細胞 HepG2再分化的分子機制是，重建了肝癌細胞HepG2中HNF4α、HNF1