牛源犬新孢子蟲NcMAG1與IFN-γ融合基因的表達(dá)及免疫學(xué)評(píng)價(jià).pdf

1、新孢子蟲病是危害養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展的重要原蟲病之一，該病可垂直傳播，主要造成妊娠母牛的流產(chǎn)、死胎以及新生兒的運(yùn)動(dòng)和神經(jīng)系統(tǒng)障礙。目前尚無有效藥物和疫苗防控該病的流行與發(fā)展，基因佐劑疫苗的研究為犬新孢子蟲新型疫苗的研制開辟了新的思路。
　　本試驗(yàn)根據(jù)發(fā)表的犬新孢子蟲NcMAG1基因序列（EF580924.1）和牛IFN-γ基因序列（M29867.1），設(shè)計(jì)、合成了兩組特異性引物，應(yīng)用PCR技術(shù)分別擴(kuò)增牛源犬新孢子蟲NcMAG1和牛IFN

2、-γ基因，SOE-PCR技術(shù)拼接NcMAG1和IFN-γ基因，將鑒定正確的NcMAG1-IFN-γ基因克隆到pMD18-T simple載體上，再將PCR和酶切鑒定正確的NcMAG1-IFN-γ亞克隆至 pGEX-4T-1原核表達(dá)載體和pVAXI真核表達(dá)載體中，分別進(jìn)行原核表達(dá)和真核表達(dá)，制備NcMAG1-IFN-γ融合蛋白亞單位疫苗和NcMAG1-IFN-γ融合基因核酸疫苗，接種BALB/c小鼠，應(yīng)用間接 ELISA方法和流式細(xì)胞術(shù)檢

3、測(cè)免疫小鼠的體液免疫水平和細(xì)胞免疫水平，評(píng)價(jià)疫苗的免疫應(yīng)答效果。
　　結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增NcMAG1基因片段大小為1047bp，IFN-γ基因片段大小為444bp，SOE-PCR擴(kuò)增NcNcMAG1-IFN-γ融合基因大小為1491bp；成功構(gòu)建了含有NcMAG1-IFN-γ融合基因的原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-NcMAG1-IFN-γ和真核表達(dá)質(zhì)粒 pVAX-NcMAG1-IFN-γ。原核表達(dá)產(chǎn)物經(jīng) SDS-PAGE電泳和Weste

4、rn-blotting分析，表達(dá)融合蛋白大小為82 ku；真核表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)IFAT鑒定和Western-blotting分析，NcMAG1-IFN-γ融合基因在Vero細(xì)胞中表達(dá)，表達(dá)蛋白分子量為57 ku，均具有較好的反應(yīng)原性。NcMAG1-IFN-γ融合蛋白亞單位疫苗和pVAX-NcMAG1-IFN-γ核酸疫苗接種BALB/c小鼠后，均能誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生較高的體液免疫水平和細(xì)胞免疫水平。本試驗(yàn)為新孢子蟲病新型疫苗的研究奠定了基