臍血樹突狀細胞介導的食管癌疫苗體內(nèi)抗癌效應.pdf

1、目的:
　　利用雜交瘤技術(shù)制備臍血樹突狀細胞(DC)和食管癌細胞EC109融合疫苗EC109-DC,觀察其在體內(nèi)誘導抗腫瘤免疫反應。
　　方法:
　　1)利用 Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離臍靜脈血單個核細胞,免疫磁珠法分離臍血CD34+干細胞。
　　2)臍血 CD34+干細胞體外用細胞因子 GM-CSF(300ng/ml)、TNF-α(150u/ml)和SCF(200ng/ml)誘導分化培養(yǎng),3

2、7℃、5％CO2飽濕條件下培養(yǎng)2周,隔日半保留換液并補加相應細胞因子,2周后收集成熟DC細胞。
　　3)聚乙二醇法(polyethyleneglycol, PEG)將DC與食管癌細胞EC109按5:1比例融合, HLA-DR MicroBeads標記, Mini MACS免疫磁式細胞分選器篩選陽性融合細胞EC109-DC。
　　4)對數(shù)生長期EC109、成熟DC、融合疫苗EC109-DC,分別用FA-FITC、CD80-PE

3、進行標記,應用流式細胞分析技術(shù)鑒定融合疫苗表型。
　　5)融合疫苗通過SCID小鼠尾靜脈及腹腔分別注射,進行體內(nèi)致瘤性實驗,觀察小鼠是否誘生腫瘤,觀察結(jié)束取小鼠脾、肝、腎等器官,石蠟切片,HE染色光鏡觀察。
　　6)人外周血淋巴細胞(PBL)小鼠腹腔注射,重建SCID小鼠人免疫系統(tǒng),定期尾靜脈取血,離心得血清,以生物素-親和素夾心ELISA法測定鼠血清中人IgG含量以判斷重建結(jié)果。
　　7)體內(nèi)抗腫瘤免疫保護實驗。取免

4、疫系統(tǒng)重建成功SCID小鼠20只,隨機分為ED、D、E和P4組,每組分別用融合細胞活疫苗、DC、滅活的EC109細胞和PBS通過尾靜脈預免疫動物,再腋下接種活EC109細胞。觀察比較小鼠體重、腫瘤出現(xiàn)時間、腫瘤大小、小鼠死亡時間及病理切片。
　　8)體內(nèi)抗腫瘤免疫治療實驗。取重建免疫系統(tǒng)成功SCID小鼠20只,待右側(cè)腋下荷瘤成功后,隨機分為ED、D、E和P4組,分別用融合細胞活疫苗、DC、滅活的EC109細胞和PBS治療動物。觀察

5、比較小鼠體重、腫瘤重量、腫瘤大小、小鼠死亡時間及病理切片。
　　結(jié)果:
　　1)免疫磁珠法分離的臍血 CD34+干細胞在細胞因子 GM-CSF、TNF-α和SCF誘導作用下開始增殖,第3天開始出現(xiàn)形態(tài)不規(guī)則細胞,并有簇狀細胞集落形成,7天時集落增大,邊緣毛刺狀,2周時集落數(shù)量減少,散在的懸浮細胞增多,呈成熟的DC形態(tài)。
　　2)EC109和DC可在體外經(jīng)PEG法成功融合,融合疫苗EC109-DC在體外培養(yǎng)可生長,呈半貼

6、壁生長,胞核大,形狀不規(guī)則,邊緣伴有小突起。
　　3)經(jīng)流式細胞分析技術(shù)分析,EC109高表達FR不表達CD80,DC高表達CD80不表達FR,疫苗則同時高表達FR和CD80。
　　4)融合疫苗接種于SCID小鼠體內(nèi)未見腫瘤形成,脾、腎和肝等器官未出現(xiàn)腫瘤病變。
　　5)免疫重建PBL組均檢測到人IgG的存在,與PBS組相比較P<0.05。
　　6)免疫保護組:經(jīng)融合疫苗免疫的小鼠,腫瘤潛伏期較對照組明顯延長(P

7、<0.05),腫瘤大小和腫瘤重量均明顯小于對照組(P<0.05)。
　　7)免疫治療組:用融合疫苗治療的荷瘤小鼠,腫瘤大小和重量明顯小于對照組(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1)經(jīng)流式細胞分析技術(shù)分析顯示,EC109高表達FR。
　　2)經(jīng)PEG法融合和Mini MACS免疫磁式細胞分選法篩選的融合疫苗EC109-DC同時高表達EC109和DC特異性抗原,提示融合成功。
　　3) DC與EC109的融合