基于公共序列數(shù)據(jù)庫的Cucumis屬EST-SSR標記的鑒定、開發(fā)和利用.pdf

1、SSR標記具有重復(fù)性好、多態(tài)性高、呈共顯性遺傳、數(shù)量豐富和遍布整個基因組等優(yōu)點，這些優(yōu)點使得SSR標記成為廣泛使用的分子標記之一，然而按照傳統(tǒng)的方法開發(fā)SSR標記不僅費時費力而且效率低。隨著功能基因組學的發(fā)展，EST因為可以用于新基因的發(fā)現(xiàn)、基因表達調(diào)控研究和基因芯片的底物而被大量測序，并保存在公共序列數(shù)據(jù)庫中，這些EST為SSR等分子標記的開發(fā)提供了豐富的序列資源?；贓ST序列開發(fā)的EST-SSR標記與傳統(tǒng)的SSR標記相比有很多優(yōu)點

2、，如：EST-SSR標記在相關(guān)物種之間具有很高的可轉(zhuǎn)移性；EST-SSR標記通常都代表著某種功能，這種功能可以通過序列同源性比對獲得；由于利用的是公共序列，EST-SSR標記的開發(fā)過程簡單成本低；EST-SSR能夠反映出轉(zhuǎn)錄區(qū)的差異，這使得EST-SSR在種質(zhì)遺傳多樣性分析、分子標記輔助選擇和比較作圖等研究中具有更高的使用價值。 Cucumis屬包括甜瓜和黃瓜兩種重要的蔬菜作物，這兩種蔬菜在世界上廣泛種植，具有重要的經(jīng)濟價值，開

3、發(fā)黃瓜和甜瓜上可用的EST-SSR標記對于這兩種作物的遺傳育種研究有著重要的意義。利用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)對公共序列數(shù)據(jù)庫中的黃瓜和甜瓜EST上的SSR位點進行了鑒定和分布特征分析，開發(fā)了42個具有多態(tài)性的EST-SSR標記，評價了這些標記在Cucumis屬種質(zhì)系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系研究中的應(yīng)用，獲得了以下結(jié)果： 從GenBank中共獲得了5563條來自于黃瓜的EST和基因序列以及5748條來自于甜瓜的EST和基因序列。對這些序列分別進行組裝，獲

4、得3627條黃瓜的Unigene，其覆蓋長度為2.2Mb；3189 條甜瓜 Unigene，覆蓋長度為 1.8Mb。以重復(fù)基序長度為2～6bp、最低重復(fù)次數(shù)5次為標準，在Unigene上搜尋SSR位點，在黃瓜上獲得了479個SSR位點，其發(fā)生頻率為1/4.6kb；在甜瓜上獲得385個SSR位點，其發(fā)生頻率為 1/4.7kb。黃瓜和甜瓜的 EST-SSR具有很多共同的特征：在SSR位點中，主要是二核苷酸重復(fù)，其次是三核苷酸重復(fù)；在二核苷酸

5、重復(fù)中，主要的基序類型是AG，其次是AT；在三核苷酸重復(fù)中，主要基序類型是AAG；位于CDS區(qū)的SSR位點數(shù)量最多，其次是5’UTR和3’UTR；卡方檢驗表明，三核苷酸基序在CDS區(qū)和UTR區(qū)是隨機分布的，而二核苷酸基序并不是隨機分布，其在UTR區(qū)的分布密度要極顯著地高于在CDS區(qū)的分布密度，在甜瓜上3’UTR區(qū)的 EST-SSR數(shù)量要極顯著地高于5’UTR，表明二核苷酸重復(fù)基序和三核苷酸重復(fù)基序在CDS和UTR區(qū)的選擇壓力不同。

6、 在黃瓜上選擇了54個SSR位點合成側(cè)翼引物，在12個黃瓜基因型上評價這些SSR位點的多態(tài)性，其中有2對引物無擴增產(chǎn)物；3對引物有非特異性產(chǎn)物；26對引物擴增出了特異性產(chǎn)物，但并無多態(tài)性；23對引物在20個位點上擴增出了特異性的具有多態(tài)性的產(chǎn)物。在多態(tài)性EST-SSR位點上最多檢測到了6個等位基因，平均每個位點能夠檢測到3.3個等位基因，平均觀測雜合度和平均期望雜合度分別為0.404和0.465，有13個EST-SSR位點顯著地偏離

7、Hardy-Weinberg平衡，有10個多態(tài)性 EST-SSR位點所在的EST序列與已知的功能基因或核苷酸序列有顯著的同源性。可轉(zhuǎn)移性分析表明，有13個引物對在甜瓜上有特異性擴增產(chǎn)物，占總數(shù)的65％，其中有7個(35％)引物對在測試的甜瓜基因型上表現(xiàn)出多態(tài)性。在甜瓜上共合成56對EST-SSR引物，其中4對引物無擴增產(chǎn)物；5對引物有非特異性擴增產(chǎn)物；25對引物有特異性擴增產(chǎn)物，但無多態(tài)性；22對引物擴增出特異性的多態(tài)性產(chǎn)物。這22對引

8、物在27個黃瓜基因型上最多檢測到了5個等位基因，平均每個位點檢測到2.9個等位基因，平均觀測雜合度為0.340，平均期望雜合度為0.442。有17個 EST-SSR位點顯著的偏離Hardy-Weinberg平衡。在CM01和CM33，CM16和CM33之間有顯著的連鎖不平衡關(guān)系存在。有13個多態(tài)性EST-SSR位點所在的EST序列與已知的功能基因或核苷酸序列有顯著的同源性?？赊D(zhuǎn)移性分析表明，有15個引物對在黃瓜上獲得了特異性擴增產(chǎn)物，占

9、總數(shù)的68.2％。 利用多態(tài)性EST-SSR標記分別對黃瓜和甜瓜材料的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系進行了評價。20個黃瓜EST-SSR 在 12 份黃瓜種質(zhì)上檢測到的 PIC 值為0.153～0.733，平均PIC值為0.446。12份種質(zhì)兩兩之間的Jaccard相似系數(shù)范圍為0.142～0.935。利用UPGMA法進行系統(tǒng)聚類分析，可以將12份種質(zhì)顯著地分為歐洲種質(zhì)和我國種質(zhì)(Bootstrap值大于99％)，主坐標分析還可以將我國黃瓜種質(zhì)進