棗樹GPX、ZjPIP2和ZjMT基因的功能分析.pdf

1、棗樹的原產(chǎn)地是中國，是一種特有的果樹，棗樹在我國的栽培歷史有3000多年。它抗逆性強(qiáng)，耐寒、抗旱、抗氧化，適合在貧瘠土壤中生長。棗樹的這些特性明顯優(yōu)于其他作物，因此，棗樹的抗逆性基因是非常寶貴的遺傳資源。本研究以“壺瓶棗”結(jié)果枝cDNA文庫中獲得的谷胱甘肽過氧化物酶基因、水通道蛋白基因和金屬硫蛋白基因?yàn)檠芯繉?duì)象，以棗樹組培苗為試材，分析了3個(gè)基因在非生物脅迫條件下的表達(dá)特性;構(gòu)建了3個(gè)基因的植物表達(dá)載體，通過轉(zhuǎn)基因的方法，將其轉(zhuǎn)到模式植

2、物擬南芥，進(jìn)行了基因的細(xì)胞定位與功能分析。以期了解棗樹的抗逆機(jī)制，為進(jìn)一步充分利用這些優(yōu)良基因提高植物的抗逆性提供一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和奠定理論基礎(chǔ)。
　　1、棗樹谷胱甘肽過氧化物酶基因
　　(1)棗樹谷胱甘肽過氧化物酶基因在棗苗中的表達(dá)
　　(2)棗樹谷胱甘肽過氧化物酶基因的功能分析:
　　2、棗樹水通道蛋白基因（ZjPIP2）
　　(1)棗樹水通道蛋白基因（ZjPIP2）在棗苗內(nèi)的表達(dá)
　　以“辣椒棗”

3、組培苗生根培養(yǎng)苗為試材，選取長勢一致的組培苗進(jìn)行模擬干旱(PEG6000)、NaCl脅迫。熒光定量RT-PCR結(jié)果表明，ZjPIP2受到干旱脅迫后，隨著時(shí)間和滲透勢的增高，表達(dá)量先上升后降低。0.5MPa脅迫時(shí)，1h以內(nèi)隨時(shí)間的延長，表達(dá)量依次上升，1h時(shí)大到最大;1h后表達(dá)量開始下降，到48h降至最小;0.8MPa脅迫時(shí)，45min表達(dá)量達(dá)到最大，45min后依次降低;1.2MPa脅迫時(shí)，45min表達(dá)量最大，45min后依次減少。不

4、同濃度的PEG6000脅迫，以低濃的0.8MPa脅迫下ZjPIP2的表達(dá)量最高。
　　ZjPIP2受到鹽脅迫后，表達(dá)量隨著時(shí)間和濃度的增高，先上升后降低又升高。50mmol/L脅迫時(shí)，1h表達(dá)量達(dá)到最大，1h后開始下降，24h、48h表達(dá)量又開始升高;100mmol/L脅迫時(shí)，1h表達(dá)量達(dá)到最大，1h后開始下降，48h表達(dá)量又開始上升;200mmol/L脅迫時(shí)，45min表達(dá)量達(dá)到最高，然后降低，24h、48h表達(dá)量又開始上升;3

5、00mmol/L脅迫時(shí)，在45min表達(dá)量達(dá)到第一次最大，隨后表達(dá)量開始下降，24h、48h表達(dá)量開始升高。
　　(2)棗樹水通道蛋白基因（ZjPIP2）的功能分析
　　將獲得的棗樹水通道蛋白基因ZjPIP2連接到植物表達(dá)載體PEZR(K)-LNY上，構(gòu)建了融合表達(dá)ZjPIP2和黃色熒光蛋白YFP的工程菌PEZR(K)-LNY-ZjPIP2-L，工程菌轉(zhuǎn)化擬南芥后，獲得含有ZjPIP2的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株T0代19株，經(jīng)PCR

6、鑒定目的基因ZjPIP2成功轉(zhuǎn)入擬南芥。將轉(zhuǎn)ZjPIP2基因的T2代擬南芥種子播種在加不同濃度NaCl的1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行耐鹽性評(píng)價(jià)，15天后觀察其生長狀況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)ZjPIP2基因擬南芥植株在鹽脅迫處理下長勢和根系明顯好于野生型(WT)擬南芥植株。
　　對(duì)轉(zhuǎn)基因植株有不育的花器官，進(jìn)行顯微鏡形態(tài)觀察初步判定，是轉(zhuǎn)基因植株的雄蕊發(fā)育不全造成的。轉(zhuǎn)基因植株的細(xì)胞學(xué)觀察表明，ZjPIP2在葉片表皮細(xì)胞膜、細(xì)胞核膜和氣孔保衛(wèi)細(xì)胞膜，根

7、毛細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)有大量表達(dá)。充分證明ZjPIP2是一個(gè)膜蛋白基因，其表達(dá)產(chǎn)物通過調(diào)節(jié)膜的透性減少水分脅迫給植物體的傷害。
　　3、棗樹金屬硫蛋白基因(ZjMT)
　　(1)棗樹金屬硫蛋白基因(ZjMT)在棗苗中的表達(dá)
　　以“辣椒棗”組培生根培養(yǎng)苗為試材，選取長勢一直的進(jìn)行模擬干旱(PEG6000)、NaCl和CdCl2脅迫。采集樣品分別提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行熒光定量PCR分析。結(jié)果表明，ZjMT受到PEG6000

8、脅迫后，表達(dá)量隨著時(shí)間和滲透勢的增高，先上升后降低。0.5MPa脅迫時(shí)，隨著時(shí)間的增加，表達(dá)量依次上升，45min表達(dá)量最大，而后表達(dá)量開始下降，到48h表達(dá)量最小;0.8MPa脅迫時(shí)，45min表達(dá)量達(dá)到最大，而后依次減少;1.2MPa脅迫時(shí)，30min表達(dá)量最大，而后表達(dá)量依次減少。不同濃度PEG6000脅迫時(shí)，ZjMT表達(dá)量以較低濃度即0.5MPa處理在各個(gè)時(shí)間段中最高。
　　受到鹽脅迫后，ZjMT表達(dá)量隨著時(shí)間和濃度的增高

9、，呈先上升后降低。50mmol/L脅迫時(shí)，在45min表達(dá)量達(dá)到最大;100mmol/L脅迫時(shí)，在45min表達(dá)量達(dá)到最大;200mmol/L脅迫時(shí)，在30min表達(dá)量達(dá)到最大;300mmol/L脅迫時(shí)，在30min表達(dá)量達(dá)到最大。
　　CdCl2脅迫后，ZjMT表達(dá)量隨著時(shí)間和濃度的增高，呈現(xiàn)先升高后降低又升高又降低，100mmol/L脅迫時(shí)，在6h表達(dá)量達(dá)到第一次最大，在24h表達(dá)量達(dá)到第二次最大，48h時(shí)表達(dá)量降到最低，整個(gè)

10、過程中轉(zhuǎn)基因的棗苗的表達(dá)量要比對(duì)照組的表達(dá)量高。因此證明ZjMT與棗樹的抗旱、耐鹽性、抗重金屬有關(guān)。
　　(2)轉(zhuǎn)棗樹金屬硫蛋白基因(ZjMT)擬南芥的耐鹽性鑒定和細(xì)胞定位
　　利用已構(gòu)建的的工程菌PEZR(K)-LNY-ZjMT-L轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得轉(zhuǎn)ZjMT基因擬南芥T0代植株15株，通過PCR鑒定篩選出的擬南芥，PCR結(jié)果顯示擬南芥已被成功轉(zhuǎn)入目的基因ZjMT。將轉(zhuǎn)ZjMT基因的T2代擬南芥種子和野生型(WT)擬南芥種子