棗樹GPX、ZjPIP2和ZjMT基因的功能分析.pdf

1、棗樹的原產地是中國，是一種特有的果樹，棗樹在我國的栽培歷史有3000多年。它抗逆性強，耐寒、抗旱、抗氧化，適合在貧瘠土壤中生長。棗樹的這些特性明顯優(yōu)于其他作物，因此，棗樹的抗逆性基因是非常寶貴的遺傳資源。本研究以“壺瓶棗”結果枝cDNA文庫中獲得的谷胱甘肽過氧化物酶基因、水通道蛋白基因和金屬硫蛋白基因為研究對象，以棗樹組培苗為試材，分析了3個基因在非生物脅迫條件下的表達特性;構建了3個基因的植物表達載體，通過轉基因的方法，將其轉到模式植

2、物擬南芥，進行了基因的細胞定位與功能分析。以期了解棗樹的抗逆機制，為進一步充分利用這些優(yōu)良基因提高植物的抗逆性提供一定的實驗數(shù)據和奠定理論基礎。
　　1、棗樹谷胱甘肽過氧化物酶基因
　　(1)棗樹谷胱甘肽過氧化物酶基因在棗苗中的表達
　　(2)棗樹谷胱甘肽過氧化物酶基因的功能分析:
　　2、棗樹水通道蛋白基因（ZjPIP2）
　　(1)棗樹水通道蛋白基因（ZjPIP2）在棗苗內的表達
　　以“辣椒棗”

3、組培苗生根培養(yǎng)苗為試材，選取長勢一致的組培苗進行模擬干旱(PEG6000)、NaCl脅迫。熒光定量RT-PCR結果表明，ZjPIP2受到干旱脅迫后，隨著時間和滲透勢的增高，表達量先上升后降低。0.5MPa脅迫時，1h以內隨時間的延長，表達量依次上升，1h時大到最大;1h后表達量開始下降，到48h降至最小;0.8MPa脅迫時，45min表達量達到最大，45min后依次降低;1.2MPa脅迫時，45min表達量最大，45min后依次減少。不

4、同濃度的PEG6000脅迫，以低濃的0.8MPa脅迫下ZjPIP2的表達量最高。
　　ZjPIP2受到鹽脅迫后，表達量隨著時間和濃度的增高，先上升后降低又升高。50mmol/L脅迫時，1h表達量達到最大，1h后開始下降，24h、48h表達量又開始升高;100mmol/L脅迫時，1h表達量達到最大，1h后開始下降，48h表達量又開始上升;200mmol/L脅迫時，45min表達量達到最高，然后降低，24h、48h表達量又開始上升;3

5、00mmol/L脅迫時，在45min表達量達到第一次最大，隨后表達量開始下降，24h、48h表達量開始升高。
　　(2)棗樹水通道蛋白基因（ZjPIP2）的功能分析
　　將獲得的棗樹水通道蛋白基因ZjPIP2連接到植物表達載體PEZR(K)-LNY上，構建了融合表達ZjPIP2和黃色熒光蛋白YFP的工程菌PEZR(K)-LNY-ZjPIP2-L，工程菌轉化擬南芥后，獲得含有ZjPIP2的轉基因擬南芥植株T0代19株，經PCR

6、鑒定目的基因ZjPIP2成功轉入擬南芥。將轉ZjPIP2基因的T2代擬南芥種子播種在加不同濃度NaCl的1/2MS培養(yǎng)基上進行耐鹽性評價，15天后觀察其生長狀況，發(fā)現(xiàn)轉ZjPIP2基因擬南芥植株在鹽脅迫處理下長勢和根系明顯好于野生型(WT)擬南芥植株。
　　對轉基因植株有不育的花器官，進行顯微鏡形態(tài)觀察初步判定，是轉基因植株的雄蕊發(fā)育不全造成的。轉基因植株的細胞學觀察表明，ZjPIP2在葉片表皮細胞膜、細胞核膜和氣孔保衛(wèi)細胞膜，根

7、毛細胞膜和細胞內有大量表達。充分證明ZjPIP2是一個膜蛋白基因，其表達產物通過調節(jié)膜的透性減少水分脅迫給植物體的傷害。
　　3、棗樹金屬硫蛋白基因(ZjMT)
　　(1)棗樹金屬硫蛋白基因(ZjMT)在棗苗中的表達
　　以“辣椒棗”組培生根培養(yǎng)苗為試材，選取長勢一直的進行模擬干旱(PEG6000)、NaCl和CdCl2脅迫。采集樣品分別提取RNA，反轉錄后，進行熒光定量PCR分析。結果表明，ZjMT受到PEG6000

8、脅迫后，表達量隨著時間和滲透勢的增高，先上升后降低。0.5MPa脅迫時，隨著時間的增加，表達量依次上升，45min表達量最大，而后表達量開始下降，到48h表達量最小;0.8MPa脅迫時，45min表達量達到最大，而后依次減少;1.2MPa脅迫時，30min表達量最大，而后表達量依次減少。不同濃度PEG6000脅迫時，ZjMT表達量以較低濃度即0.5MPa處理在各個時間段中最高。
　　受到鹽脅迫后，ZjMT表達量隨著時間和濃度的增高

9、，呈先上升后降低。50mmol/L脅迫時，在45min表達量達到最大;100mmol/L脅迫時，在45min表達量達到最大;200mmol/L脅迫時，在30min表達量達到最大;300mmol/L脅迫時，在30min表達量達到最大。
　　CdCl2脅迫后，ZjMT表達量隨著時間和濃度的增高，呈現(xiàn)先升高后降低又升高又降低，100mmol/L脅迫時，在6h表達量達到第一次最大，在24h表達量達到第二次最大，48h時表達量降到最低，整個

10、過程中轉基因的棗苗的表達量要比對照組的表達量高。因此證明ZjMT與棗樹的抗旱、耐鹽性、抗重金屬有關。
　　(2)轉棗樹金屬硫蛋白基因(ZjMT)擬南芥的耐鹽性鑒定和細胞定位
　　利用已構建的的工程菌PEZR(K)-LNY-ZjMT-L轉化擬南芥，獲得轉ZjMT基因擬南芥T0代植株15株，通過PCR鑒定篩選出的擬南芥，PCR結果顯示擬南芥已被成功轉入目的基因ZjMT。將轉ZjMT基因的T2代擬南芥種子和野生型(WT)擬南芥種子