逍遙散抗抑郁有效部位中白術(shù)內(nèi)酯類成分藥代動力學(xué)研究.pdf

1、選題依據(jù):隨著社會壓力的增大,抑郁癥患病率逐年增多,作為抗抑郁經(jīng)典名方的逍遙散成為了近年來研究的焦點(diǎn),目前有關(guān)逍遙散的研究多集中于藥理活性及作用機(jī)制的研究。經(jīng)過多年的基礎(chǔ)研究和臨床實踐均表明其具有良好的抗抑郁作用。逍遙散由8種單味藥組成,成分復(fù)雜,本課題組在前期研究中,通過極性分離得到的逍遙散石油醚部位,經(jīng)大量藥理實驗證明抗抑郁活性尤為顯著。然而,目前該復(fù)方有效部位應(yīng)如何合理用藥尚缺乏實驗依據(jù),目前有關(guān)其藥代動力學(xué)的研究甚少。故而針對該

2、中藥復(fù)方有效部位的藥代動力學(xué)研究必不可少。本課題組前期根據(jù)譜-效關(guān)系的研究,表明其抗抑郁有效組分來自柴胡、當(dāng)歸、白術(shù)。其中白術(shù)藥材屬佐藥,具益氣補(bǔ)中、健脾燥濕,基于其成分的復(fù)雜性,本課題組又根據(jù)血清藥化的理論,認(rèn)為能夠入血的成分才有可能為起效成分,通過實驗證明逍遙散中源于單味藥白術(shù)的能夠入血的成分主要為白術(shù)內(nèi)酯I、II和III。然而,白術(shù)內(nèi)酯類成分的體內(nèi)藥動學(xué)特點(diǎn)、組織分布及吸收規(guī)律尚不清楚,若明確這些特征,將為劑型選擇及臨床給藥方案的

3、制定提供依據(jù)。為此,本研究以白術(shù)內(nèi)酯類成分作為研究對象,進(jìn)行逍遙散石油醚部位白術(shù)內(nèi)酯類成分的藥代動力學(xué)研究,以期為逍遙散的合理用藥提供一定依據(jù)。
　　目的:灌胃給予大鼠逍遙散復(fù)方與白術(shù)單味藥材的石油醚部位,研究白術(shù)內(nèi)酯類成分在大鼠血清中的藥動學(xué)特性、各組織分布特點(diǎn)以及經(jīng)糞便、尿液的排泄規(guī)律;并采用離體腸翻轉(zhuǎn)模型,研究逍遙散復(fù)方與白術(shù)單味藥石油醚部位在大鼠小腸中的吸收動力學(xué)并探索配伍對白術(shù)內(nèi)酯類成分吸收的影響。為后期藥物新藥研發(fā)、毒

4、理研究及臨床合理用藥提供一定科學(xué)依據(jù)。
　　方法:1.建立血清中白術(shù)內(nèi)酯I、II和III的HPLC-MS/MS定量測定方法,并用于藥代動力學(xué)研究;分別建立大鼠組織、尿液、糞便及離體腸吸收液中白術(shù)內(nèi)酯I、II和III的UPLC-PDA定量測定方法,并用于表征此類成分在大鼠組織、尿液、糞便及離體腸吸收液的行為特征。
　　2.選用雄性成年SD大鼠,隨機(jī)分為逍遙散組、白術(shù)高劑量組、白術(shù)中劑量組、白術(shù)低劑量組4個組,分別于灌胃前及灌胃

5、后0.17、0.42、0.67、1、1.5、2、4、8、12、24和36h經(jīng)眼眶取血,采用上述建立的HPLC-MS/MS法測定血藥濃度,并比較藥動學(xué)行為差異。
　　3.另選用成年SD大鼠,隨機(jī)分為2組,即逍遙散給藥組、白術(shù)藥材高劑量組,每組25只大鼠,其中20只分別于給藥后15、60、90min和4h分離不同組織,另外5只于給藥后0~2 h,2~4 h,4~6 h,6~8 h,8~12 h,12~24 h,24~36 h,36~4

6、8 h,48~60 h不同時間段收集尿液、糞便樣本。采用UPLC-PDA法分別測定白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ隨時間推移的含量動態(tài)變化規(guī)律,并比較其在配伍前后給藥情況下不同組織的分布特性及排泄規(guī)律差異。
　　4.建立離體腸翻轉(zhuǎn)模型,SD雄性大鼠于禁食12h后,分離小腸段,制備小腸腸囊并置于逍遙散復(fù)方及白術(shù)單味藥供試液試管中,于37℃恒溫水浴中孵育后,采用UPLC-PDA法梯度洗脫,于240nm下檢測并指認(rèn)逍遙散復(fù)方及白術(shù)單味藥吸收液中的成分

7、,并歸屬共有峰。
　　另外飼養(yǎng)12只雄性SD大鼠,于禁食12h后,分離大鼠小腸不同腸段(十二指腸、空腸、回腸),并將腸段隨機(jī)分為逍遙散組、白術(shù)高劑量組、白術(shù)中劑量組、白術(shù)低劑量組4個組,進(jìn)行離體腸吸收實驗,采用UPLC-PDA法等度洗脫,并于220nm、277nm雙波長檢測不同時間點(diǎn)吸收液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ含量,并以白術(shù)內(nèi)酯的經(jīng)時累積吸收量對時間作相關(guān)回歸分析,獲得其隨時間的動態(tài)變化規(guī)律。其次,比較不同濃度白術(shù)供試液中白術(shù)內(nèi)酯在

8、大鼠不同腸的吸收,判斷其轉(zhuǎn)運(yùn)是否存在濃度依賴性以及特定吸收窗。再次,根據(jù)復(fù)方與單味藥的吸收結(jié)果,比較配伍對白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ吸收的影響。從而明確該類成分在小腸中的吸收特性。
　　結(jié)果:1.建立了血清中白術(shù)內(nèi)酯類成分的HPLC-MS/MS定量測定方法,經(jīng)方法學(xué)考察,該方法所中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ能達(dá)到的定量限分別為0.117、0.094和0.509ng?mL-1,表明該方法靈敏度較高。根據(jù)精密度、回收率、穩(wěn)定性及基質(zhì)效應(yīng)等的考察結(jié)果可

9、知,該方法穩(wěn)定、可靠。
　　分別建立了大鼠組織、尿液、糞便及離體腸吸收液的UPLC-PDA測定方法,這幾種樣本的色譜測定條件一致,待測物均能在5min內(nèi)于波長220nm(白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅲ)和277nm(白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ)條件下較好的分離白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,每種樣本的測定方法經(jīng)方法學(xué)考察,結(jié)果表明方法靈敏、穩(wěn)定、可靠。
　　2.在藥代動力學(xué)實驗中,白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ基于相似的結(jié)構(gòu),其藥-時曲線呈現(xiàn)一定的相似性。根據(jù)中劑量組藥動參數(shù)可知

10、,白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的Tmax分別為1.08±0.39、0.44±0.07和0.31±0.17,,達(dá)峰時間均在1h左右,表明其具有吸收快的特點(diǎn);從參數(shù)t1/2β可得,白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的t1/2β分別為3.53±2.16、9.72±6.61和4.51±3.99,表明白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ的消除較快,而白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ的消除相對于前兩者較慢。另外,根據(jù)低、中、高劑量組的設(shè)置,發(fā)現(xiàn)該三種成分的含量線性增加,呈劑量依賴型。經(jīng)過單位劑量濃度與單位劑量AUC的

11、比較,發(fā)現(xiàn)復(fù)方組與白術(shù)低劑量組兩組中的白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ無明顯變化,而復(fù)方組中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ相對于白術(shù)低劑量組明顯降低(P<0.05)。方差分析復(fù)方組與白術(shù)低劑量組的Tmax與Tmax,結(jié)果表明復(fù)方配伍有減慢白術(shù)內(nèi)酯吸收速率,增加白術(shù)內(nèi)酯的消除速率的趨勢。
　　3.組織分布與排泄實驗中,復(fù)方組的組織及排泄樣本中均未檢測到白術(shù)內(nèi)酯。而根據(jù)單味藥白術(shù)的組織分布實驗情況來看,白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在肝臟中的分布均較多,除此之外,白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ在脾、腎中

12、的含量較大,白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ在肺中的分布量最大,表明此兩種成分與相應(yīng)的組織間存在著某種特殊的親和力;從分布時間觀察可知,白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ在60min時分布量最大,而白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ則分布相對較快,15min時含量最高。排泄實驗中,尿液中僅檢測到了白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ,而在糞便中三種成分均可檢測到,表明白術(shù)內(nèi)酯的排泄方式主要通過糞便排出;另外,排泄率的順序為Ⅲ>Ⅰ、Ⅱ,且白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ的排泄率較低,可知白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ可能主要以代謝物的形式排出體外。
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13、.離體腸吸收實驗中,逍遙散復(fù)方及白術(shù)單味藥的大部分成分均可被小腸吸收,分別發(fā)現(xiàn)了32和25個吸收峰,根據(jù)紫外吸收特征及對照品比對,白術(shù)單味藥中的成分主要為白術(shù)內(nèi)酯類、多炔類以及其他未知成分;另外,發(fā)現(xiàn)了兩個較為特別的多炔類成分,疑似為腸道菌群的代謝產(chǎn)物。而復(fù)方吸收液中的成分主要為多炔類、白術(shù)內(nèi)酯類以及來源于當(dāng)歸的藁本內(nèi)酯成分,經(jīng)比對,復(fù)方與白術(shù)吸收液的共有峰有三個,經(jīng)指認(rèn)分別為白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。腸吸收動力學(xué)實驗中,以白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ

14、在不同腸段的經(jīng)時累積吸收量對時間進(jìn)行回歸分析可知,三種成分在不同腸段均為線性吸收,回歸相關(guān)系數(shù)大于0.9;經(jīng)不同濃度白術(shù)供試液中白術(shù)內(nèi)酯在大鼠腸段不同部位的吸收研究,發(fā)現(xiàn)三種成分的吸收對濃度具有依賴性,無特定吸收窗;方差分析逍遙散復(fù)方及白術(shù)單味藥的經(jīng)時累積量可知,兩組無顯著性差異(P>0.05),表明配伍對白術(shù)內(nèi)酯類成分的吸收沒有明顯的影響。
　　結(jié)論:本研究建立的分析方法靈敏可行,可成功用于藥代動力學(xué)研究,并分別獲得了白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ