保護(hù)性基因血紅素加氧酶-1在減輕肝臟缺血再灌注損傷中的機(jī)制研究.pdf

1、根據(jù)最新研究發(fā)現(xiàn)，肥大細(xì)胞在心、腦、腸等器官的缺血再灌注損傷中發(fā)生脫顆粒并且能加重缺血再灌注損傷，推斷肥大細(xì)胞在肝臟缺血再灌注損傷中也發(fā)生脫顆粒并且加重局部損傷，再結(jié)合機(jī)體自身保護(hù)性基因血紅素加氧酶-1（HO-1）參與免疫調(diào)控，具有抗炎、抗過(guò)敏、抗凋亡等作用，從而提出機(jī)體保護(hù)性基因HO-1減輕肝臟缺血再灌注損傷的可能途徑：抑制肥大細(xì)胞脫顆粒。以大鼠肝臟缺血再灌注損傷為研究對(duì)象，運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）、western bl

2、ot 等技術(shù)檢測(cè)肝臟HO-1核酸水平、蛋白水平的變化，常規(guī)檢測(cè)外周血中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶的變化等指標(biāo)，甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)肝臟中肥大細(xì)胞性狀和數(shù)量的變化，HE染色檢測(cè)肝臟組織損傷變化，免疫組化技術(shù)檢測(cè)Kupffer細(xì)胞功能變化，綜合評(píng)價(jià)上述變化對(duì)肝臟缺血再灌注損傷的影響，在體驗(yàn)證上述理論推測(cè)，為闡明HO-1與肥大細(xì)胞在肝臟I/RI中的作用機(jī)制，并為臨床防治肝臟缺血再灌注損傷提供新的調(diào)控靶點(diǎn)。本研究分為三個(gè)部分：
　　 第一部分：

3、HO-1表達(dá)和肥大細(xì)胞脫顆粒在肝臟缺血再灌注損傷中的變化觀(guān)察。
　　 目的：研究肝臟缺血再灌注損傷過(guò)程中大鼠肝臟保護(hù)性基因血紅素加氧酶-1（HO-1）的表達(dá)以及肥大細(xì)胞脫顆粒的變化。
　　 方法：將實(shí)驗(yàn)雄性SD大鼠隨機(jī)分為8組，每組5只：假手術(shù)組(Sham組)、1h組、2h組、4h組、6h組、8h組、12h組、24h組。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)麻醉消毒開(kāi)腹后，暴露肝門(mén)部，采用無(wú)損傷血管夾夾閉左中葉肝蒂1h后放開(kāi)，分別于再灌注后1h、2

4、h、4h、6h、8h、12h、24h取外周血標(biāo)本和肝臟組織標(biāo)本，Sham組只開(kāi)腹不做其他處理。RT-PCR法檢測(cè)肝組織中HO-1 mRNA的表達(dá)變化；采用Western blot法檢測(cè)肝組織中HO-1蛋白表達(dá)變化；常規(guī)檢測(cè)外周血中轉(zhuǎn)氨酶水平的變化。病理切片染色檢測(cè)肝臟中肥大細(xì)胞性狀和數(shù)量的變化。
　　 結(jié)果：肝臟缺血再灌注后，實(shí)驗(yàn)組HO-1 mRNA表達(dá)、HO-1蛋白表達(dá)、外周血轉(zhuǎn)氨酶水平以及肥大細(xì)胞脫顆粒數(shù)明顯高于Sham組，

5、其中6h組和8h組HO-1 mRNA表達(dá)、蛋白表達(dá)以及外周血轉(zhuǎn)氨酶水平最高，其差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P <0.05；而2h組肥大細(xì)胞脫顆粒數(shù)量最多，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P <0.05。
　　 結(jié)論;本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明肝臟HO-1表達(dá)隨著再灌注時(shí)間的增加成拋物線(xiàn)趨勢(shì)，再灌注6-8h表達(dá)最高；肝臟缺血再灌注損傷過(guò)程中有肥大細(xì)胞發(fā)生脫顆粒，并且再灌注2h脫顆粒數(shù)量最多，這部分實(shí)驗(yàn)為后續(xù)探討HO-1與肥大細(xì)胞脫顆粒之間的關(guān)系提供了時(shí)間依據(jù)。<

6、br>　　 第二部分：上調(diào)HO-1表達(dá)抑制肥大細(xì)胞脫顆粒減輕肝臟缺血再灌注損傷。
　　 目的：缺血再灌注損傷(I/RI)是許多肝臟手術(shù)后造成器官損害的原因之一。探索肝臟I/RI的機(jī)制，減輕或防止再灌注損傷的發(fā)生，是肝臟疾病防治中亟待解決的重要課題。為了闡明HO-1與肥大細(xì)胞在肝臟I/RI中的作用機(jī)制，利用大鼠肝臟I/RI模型，深入探討肝臟中HO-1減輕肝臟I/RI的可能途徑：抑制肥大細(xì)胞脫顆粒作用。
　　 方法：將實(shí)驗(yàn)

7、雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組(n=5)： （1）假手術(shù)組（Sham組），（2）缺血再灌注損傷組（I/RI組），（3）HO-1誘導(dǎo)劑鈷原卟啉組（CoPP組），（4）HO-1抑制劑鋅原卟啉組（ZnPP組）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)麻醉消毒開(kāi)腹后，暴露肝門(mén)部，采用無(wú)損傷血管夾夾閉左中葉肝蒂1h后放開(kāi)，分別于再灌注后2h取外周血標(biāo)本和肝臟組織標(biāo)本。RT-PCR法檢測(cè)肝組織中HO-1 mRNA的表達(dá)變化；采用Western blot法檢測(cè)肝組織中HO-1蛋白表達(dá)變

8、化；常規(guī)檢測(cè)外周血中轉(zhuǎn)氨酶水平；病理切片甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)肝臟中肥大細(xì)胞性狀和數(shù)量的變化；HE染色檢測(cè)肝臟細(xì)胞損傷情況。
　　 結(jié)果：與Sham組相比，I/RI組、CoPP組、ZnPP組肝臟組織HO-1mRNA表達(dá)增加，血清ALT、AST水平升高，肥大細(xì)胞脫顆粒數(shù)量增多，肝臟細(xì)胞損傷加重。與I/RI組相比，CoPP組HO-1mRNA表達(dá)增加，血清ALT、AST水平減低，肥大細(xì)胞脫顆粒數(shù)量減少，肝細(xì)胞損傷減輕；ZnPP組HO-1mR

9、NA表達(dá)減少，血清ALT、AST水平升高，肥大細(xì)胞脫顆粒數(shù)量增多、肝細(xì)胞損傷嚴(yán)重。組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P <0.05。
　　 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明預(yù)先提高肝臟HO-1的表達(dá)能減輕缺血再灌注損傷，其作用的可能途徑是抑制肝臟中肥大細(xì)胞脫顆粒。
　　 第三部分：HO-1在肝臟中減輕缺血再灌注損傷的細(xì)胞定位研究。
　　 目的：正常狀態(tài)下的肝臟組織HO-1的表達(dá)量總是比其他實(shí)質(zhì)性臟器為高。深入探討HO-1在肝臟中減

10、輕缺血再灌注損傷的細(xì)胞來(lái)源對(duì)于肝臟缺血性相關(guān)疾病提供治療靶點(diǎn)具有重要意義。
　　 方法：將實(shí)驗(yàn)雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組(n=5)：假手術(shù)組(Sham組)、缺血再灌注損傷組(I/RI組)、GdCL3組、GdCL3+HO-1誘導(dǎo)劑鈷原卟啉組（GdCL3+CoPP組）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)麻醉消毒開(kāi)腹后，暴露肝門(mén)部，采用無(wú)損傷血管夾夾閉左中葉肝蒂1h后放開(kāi)，分別于再灌注2h后取外周血標(biāo)本和肝臟組織標(biāo)本。免疫組化檢測(cè)ED2抗原的表達(dá)，RT-PCR

11、法檢測(cè)肝組織中HO-1 mRNA的表達(dá)變化；采用Western blot法檢測(cè)肝組織中HO-1蛋白表達(dá)變化；病理切片甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)肝臟中肥大細(xì)胞性狀和數(shù)量的變化。HE染色檢測(cè)肝臟細(xì)胞損傷情況。
　　 結(jié)果：GdCL3組、GdCL3+CoPP組ED2抗原表達(dá)明顯減少，HO-1 mRNA表達(dá)、蛋白表達(dá)明顯降低，肥大細(xì)胞脫顆粒增多，肝臟損傷加重。與缺血再灌注損傷組相比，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。
　　 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)