弓形蟲(chóng)對(duì)DNA受體天然免疫通路的激活及機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:
　　弓形蟲(chóng)能感染哺乳動(dòng)物所有的有核細(xì)胞,全球約30％的人曾感染弓形蟲(chóng)。天然免疫是抵抗弓形蟲(chóng)感染的第一道防線,天然免疫細(xì)胞通過(guò)模式識(shí)別受體對(duì)弓形蟲(chóng)的病原體相關(guān)分子模式進(jìn)行識(shí)別和活化,分泌細(xì)胞因子和趨化因子從而清除弓形蟲(chóng)感染;同時(shí),弓形蟲(chóng)也分泌毒力因子蛋白抑制天然免疫信號(hào)通路從而進(jìn)行免疫逃逸。弓形蟲(chóng)侵入宿主細(xì)胞后形成納蟲(chóng)空泡,研究報(bào)道弓形蟲(chóng)的納蟲(chóng)空泡可在IFN-γ的作用下破裂,在宿主細(xì)胞質(zhì)中可檢測(cè)到弓形蟲(chóng)的DNA。細(xì)胞質(zhì)中

2、出現(xiàn)的DNA是非常重要的危險(xiǎn)信號(hào),外源性的DNA或者自身DNA在胞質(zhì)內(nèi)的積累可觸發(fā)強(qiáng)烈的天然免疫反應(yīng),誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列的細(xì)胞因子,如IFN-β等。cGAS作為新發(fā)現(xiàn)的胞質(zhì) DNA受體,通過(guò)激活 STING(干擾素基因刺激分子)、TBK1(TANK結(jié)合激酶1)、IRF3(干擾素調(diào)節(jié)因子3)誘導(dǎo)Ⅰ干擾素產(chǎn)生?；谝陨涎芯勘尘?本實(shí)驗(yàn)旨在研究弓形蟲(chóng)納蟲(chóng)空泡破裂后,其DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞質(zhì)中能否被DNA受體識(shí)別激活下游信號(hào)通路,誘導(dǎo)I型干擾素的產(chǎn)生

3、以及對(duì)該通路的活化是否依賴(lài)于STING、cGAS和TBK1等關(guān)鍵基因,闡明弓形蟲(chóng)感染的胞內(nèi)天然免疫機(jī)制,為理解胞內(nèi)病原體的天然免疫機(jī)制提供新內(nèi)容。
　　研究方法:
　　1.采用人包皮成纖維細(xì)胞(HFF)培養(yǎng)剛地弓形蟲(chóng) ME49-PTG株,抽提弓形蟲(chóng)DNA。HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染弓形蟲(chóng)DNA,用熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)檢測(cè)IFN-β、ISRE、NF-κB、AP-1基因的啟動(dòng)子表達(dá)水平。
　　2.用穩(wěn)定表達(dá)ISRE熒光素酶報(bào)告基

4、因的2FTGH細(xì)胞測(cè)定I型干擾素的蛋白水平和生物活性。
　　3.采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫印跡方法檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子IRF-3二聚體形成和活化。
　　4.通過(guò)過(guò)表達(dá)Sting、cGAS分析Sting和cGAS基因在弓形蟲(chóng)DNA活化通路中的功能。
　　5.弓形蟲(chóng)ME49-PTG株速殖子感染HEK293細(xì)胞,用熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)檢測(cè)IFN-β、ISRE、NF-κB、AP-1基因的啟動(dòng)子表達(dá)水平。
　　6.West

5、ern Blot鑒定TBK1基因敲除(TBK1-/-)和野生型TBK1+/+的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)中 TBK1蛋白表達(dá),并以弓形蟲(chóng)速殖子感染 TBK1-/-和TBK1+/+MEF細(xì)胞,q-PCR檢測(cè)IL-6、IL-18、STING、ISG15、SAG1等細(xì)胞因子基因mRNA的轉(zhuǎn)錄變化,分析TBK1基因在弓形蟲(chóng)激活天然免疫中的作用。
　　研究結(jié)果:
　　1.HEK293細(xì)胞中IFN-β、ISRE啟動(dòng)子的表達(dá)隨著轉(zhuǎn)染弓形

6、蟲(chóng)DNA量的升高而升高。
　　2.I型干擾素生物活性實(shí)驗(yàn)顯示:轉(zhuǎn)染弓形蟲(chóng)DNA后,I型干擾素的生物活性顯著性增強(qiáng),說(shuō)明弓形蟲(chóng)DNA可以誘導(dǎo)I型干擾素的產(chǎn)生,并具有生物活性。
　　3.為進(jìn)一步揭示弓形蟲(chóng)DNA在感染宿主時(shí)的作用機(jī)制,我們檢測(cè)了IFN-β上游信號(hào)通路中轉(zhuǎn)錄因子IRF-3的活化情況,結(jié)果證明弓形蟲(chóng)DNA可以使IRF-3發(fā)生二聚化,激活了IRF-3轉(zhuǎn)錄因子,說(shuō)明弓形蟲(chóng)DNA能夠通過(guò)IRF3激活I(lǐng)FN-β信號(hào)通路。

7、r>　　4.弓形蟲(chóng)DNA轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,同時(shí)過(guò)表達(dá)cGAS和STING真核質(zhì)粒,發(fā)現(xiàn)IFN-β啟動(dòng)子的表達(dá)量進(jìn)一步升高,同時(shí)I型干擾素生物活性測(cè)定顯示IFNs活性增強(qiáng),揭示弓形蟲(chóng)DNA誘導(dǎo)I型干擾素的產(chǎn)生可能通過(guò)cGAS-STING信號(hào)通路。
　　5.弓形蟲(chóng)ME49-PTG株速殖子可以促進(jìn)NF-κB啟動(dòng)子的表達(dá),揭示弓形蟲(chóng)可能活化了NF-κB信號(hào)通路,而過(guò)表達(dá)cGAS-STING對(duì)NF-κB無(wú)影響,同時(shí)弓形蟲(chóng)ME49-PTG

8、株速殖子可以輕微激活I(lǐng)FN-β,但對(duì)ISRE和AP-1影響不大。
　　6.Western Blot結(jié)果鑒定了在TBK1+/+MEF細(xì)胞中表達(dá)TBK1蛋白,而在TBK1基因敲除的MEF細(xì)胞(TBK1-/-)中TBK1蛋白不表達(dá)。用弓形蟲(chóng)速殖子感染TBK1+/+MEF細(xì)胞和TBK1-/-MEF細(xì)胞,q-PCR結(jié)果顯示,弓形蟲(chóng)內(nèi)參基因表面抗原蛋白1(SAG1)mRNA轉(zhuǎn)錄水平隨著時(shí)間的增加而升高,說(shuō)明在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中弓形蟲(chóng)的感染和

9、增殖情況;同時(shí),弓形蟲(chóng)速殖子可以抑制IL-6、IL-18、ISG15、STING的mRNA轉(zhuǎn)錄。在TBK1-/-細(xì)胞感染弓形蟲(chóng)的結(jié)果中發(fā)現(xiàn),TBK1基因敲除后,ISG15和IL-18的mRNA水平顯著下降;IL-6的mRNA水平有所升高。
　　結(jié)論:
　　1.弓形蟲(chóng)DNA能夠激活I(lǐng)RF3,使其二聚化,誘導(dǎo) IFN-β的產(chǎn)生,進(jìn)而促進(jìn)ISRE的表達(dá),該激活途徑有可能通過(guò)cGAS-STING信號(hào)通路。
　　2.弓形蟲(chóng)速殖子