弓形蟲P30-P24聯(lián)合DNA疫苗的免疫保護(hù)作用及安全性評(píng)價(jià).pdf

1、疫苗是防治弓形蟲病的有效手段之一，弓形蟲疫苗研制經(jīng)歷了全蟲疫苗、蟲體特異組分疫苗、基因工程疫苗、DNA疫苗4個(gè)發(fā)展階段。弓形蟲DNA疫苗較傳統(tǒng)疫苗雖有諸多優(yōu)勢(shì)，但尚處于研究的起步階段，單價(jià)DNA疫苗可誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)弓形蟲感染產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫，但免疫效果并不十分理想，聯(lián)合多價(jià)DNA疫苗將是弓形蟲疫苗今后的發(fā)展趨勢(shì)。此外，弓形蟲DNA疫苗的免疫保護(hù)機(jī)制和安全性還不十分清楚，進(jìn)一步探討疫苗免疫機(jī)制及其對(duì)真核細(xì)胞正?；虮磉_(dá)調(diào)控的影響，將有助

2、于研制高效、安全、實(shí)用的弓形蟲DNA疫苗。 一、弓形蟲p30、p24 DNA疫苗pVAX1-p30、pVAX1-p24的構(gòu)建及免疫功能研究 本研究利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出P30和P24基因片段，分別克隆入pVAX1載體，對(duì)重組質(zhì)粒pVAX1-p30、pVAX1-p24進(jìn)行PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定；并將重組質(zhì)粒pVAX1-p30、pVAX1-p24和空載體pVAXl轉(zhuǎn)染入小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)，建立體外真核細(xì)胞瞬時(shí)表

3、達(dá)系統(tǒng)，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色(SP法)檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物p30、p24抗原蛋白；最后將pVAX1-p30、pVAX1-p24DNA疫苗經(jīng)肌內(nèi)注射免疫BALB/c小鼠，建立弓形蟲攻擊感染小鼠模型，觀察小鼠的生存時(shí)間，檢測(cè)血清抗弓形蟲特異性IgG抗體，ELISA法測(cè)定小鼠IFN-γ、IL-2、IL-4細(xì)胞因子水平，MTT法測(cè)定免疫鼠NK細(xì)胞殺傷率，流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定CD4<'+>、CD8<'+>T細(xì)胞亞群。 結(jié)果提示，弓形蟲DNA疫苗pVA

4、X1-p30、pVAX1-p24的聯(lián)合應(yīng)用對(duì)弓形蟲感染小鼠具有免疫功效，且免疫效果優(yōu)于pVAX1-p24、pVAX1-p30單獨(dú)使用，可明顯提高小鼠的細(xì)胞免疫及體液免疫水平。 二、弓形蟲p30、p24雙基因DNA疫苗pBudCE-p24-p30的構(gòu)建及其對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響 本研究將p30、p24兩條基因片段克隆并定位于真核表達(dá)載體pBudCE4.1上，構(gòu)建pBudCE-p24、pBudCE-p30以及pBud

5、CE-p24-p30雙基因重組質(zhì)粒DNA。將重組質(zhì)粒pBudCE-p24、pBudCE-p30以及pBudCE-p24-p30和空載體pBudCE4.1轉(zhuǎn)染入小鼠巨噬細(xì)胞，建立體外真核細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色(SP法)檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物p30、p24抗原蛋白。并利用Affymetrix基因芯片研究p24及p30，特別是p24及p30協(xié)同作用對(duì)真核細(xì)胞正?；虮磉_(dá)調(diào)控的影響，對(duì)異常表達(dá)的基因進(jìn)行檢測(cè)分析，并以RT-PCR技術(shù)對(duì)表達(dá)

6、譜基因芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pBudCE-p24-p30、pBudCE-p24、pBudCE-p30構(gòu)建成功，并能夠在小鼠細(xì)胞巨噬細(xì)胞中表達(dá)p30、p24抗原蛋白。Affymetrix表達(dá)譜基因芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，雙基因DNA疫苗pBudCE-p24-p30對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞正?；虮磉_(dá)調(diào)控的影響不顯著，pBudCE-p24-p30轉(zhuǎn)染后小鼠巨噬細(xì)胞共有16個(gè)基因表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)，上調(diào)的基因有Pdlim4、Pcdh7、CA