PKM2對胃腺癌細(xì)胞增殖和凋亡作用的初步研究.pdf

1、胃癌是世界范圍內(nèi)最為常見和死亡率較高的惡性腫瘤之一，特別是在我國的東南沿海地區(qū)。在查閱文獻(xiàn)和本中心實(shí)驗(yàn)室原有工作的基礎(chǔ)上，本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)、真核載體轉(zhuǎn)染、Western blot、流式細(xì)胞術(shù)、ELISA、實(shí)時熒光定量PCR等技術(shù)，初步探討了丙酮酸激酶M2型(腫瘤M2丙酮酸激酶，PKM2)對胃腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的作用及初步機(jī)制，為臨床胃腺癌治療尋找可能的藥物作用靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。
　　第一部分應(yīng)用免疫組化技術(shù)分別測定PKM2和IL

2、-6在113例胃腺癌組織和同一患者的癌旁組織樣本中的表達(dá)，分析胃腺癌組織中是否存在PKM2過表達(dá)及其與患者臨床病理特征、生存期的關(guān)系。結(jié)果表明：在113例胃腺癌組織樣本中，PKM2過表達(dá)率為61.9％（70/113）；IL-6過表達(dá)率為61.1%（69/113）。
　　1、PKM2在胃腺癌組織中表達(dá)明顯高于配對的癌旁組織樣本中的表達(dá)，兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=9.96×10-5)。
　　2、PKM2在胃腺癌中組織中的過表達(dá)

3、和患者的性別、年齡、分化程度、腺癌的組織學(xué)類型、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無統(tǒng)計學(xué)意義，但與腫瘤大小、腫瘤 TMN分期、侵襲至漿膜外、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，特別與患者的存活顯著相關(guān)（P=4.78×10-4)。3、患者的存活和性別、年齡、分化程度、腺癌的組織學(xué)類型無關(guān)，但與腫瘤大小、腫瘤 TMN分期、侵襲及漿膜外、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、PKM2過表達(dá)密切相關(guān)。
　　4、COX模型和K-M曲線生存分析：PKM2在胃腺癌和癌旁組織中的過表達(dá)差值是1+、2+

4、、3+的患者死亡風(fēng)險分別是未過表達(dá)患者的2.66倍（HR，2.66，95%CI，0.92 to7.69；P=0.071）、10.01倍（HR，10.01，95%CI，0.92to7.69；P=2.55×10-5）、18.74倍（HR，18.74，95%CI，3.43 to29.25；P=1.64×10-5），并且過表達(dá)程度越高，風(fēng)險也就越高； PKM2過表達(dá)患者與未過表達(dá)患者之間生存時間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（Log Rank P=1.05

5、×10-5），中位生存時間（MST）從67.0月銳減為35.0月。
　　5、PKM2和IL-6在胃腺癌組織中的過表達(dá)相關(guān)分析證明兩者高度相關(guān)(R=0.678，P=2.05×10-5)。
　　第二部分應(yīng)用RT-PCR的方法從胃癌組織的總RNA中擴(kuò)增全長PKM2基因的cDNA，以BamHⅠ酶切位點(diǎn)克隆入pDsRed-Express-C1真核表達(dá)載體，經(jīng)測序證明所構(gòu)建的載體正確無誤后，再以脂質(zhì)體方法(Lipofectamine20

6、00)分別轉(zhuǎn)染入AGS和MKN-45胃腺癌細(xì)胞株中，Western-blot檢測并篩選出PKM2蛋白表達(dá)最高的 PKM2的細(xì)胞，結(jié)果表明成功地構(gòu)建了人pDsRed-Express-C1-PKM2真核表達(dá)載體，并且成功地獲得了PKM2過表達(dá)的AGS和MKN-45細(xì)胞株，從而保證了后續(xù)的研究。
　　第三部分PKM2對胃腺癌細(xì)胞增殖和凋亡作用及機(jī)制的初步研究。應(yīng)用MTT試驗(yàn)測定細(xì)胞增殖、AnnexinV染色+流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡、EL

7、ISA實(shí)驗(yàn)測定IL-6濃度、實(shí)時熒光定量PCR檢測IL-6 mRNA表達(dá)，分析PKM2過表達(dá)對胃腺癌細(xì)胞的影響(以未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染空載體為對照)。胃腺癌細(xì)胞株AGS和MKN-45 PKM2過表達(dá)組（轉(zhuǎn)染pDsRed-Express-C1-PKM2）細(xì)胞增殖能力明顯高于空載體組（轉(zhuǎn)染 pDsRed-Express-C1）細(xì)胞(control)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（AGS，P=0.031；MKN-45，P=0.038）；PKM2過表達(dá)組細(xì)胞凋亡