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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
探討乳腺癌細(xì)胞 M2型丙酮酸激酶(PKM2)與表皮生長(zhǎng)因子受體表達(dá)的相關(guān)性;探討拉帕替尼作為表皮生長(zhǎng)因子酪氨酸激酶抑制劑對(duì) PKM2表達(dá)的影響;探討拉帕替尼通過抑制 PKM2表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響;探討拉帕替尼通過抑制乳腺癌細(xì)胞PKM2表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子Stat3表達(dá)和磷酸化的影響。
方法:
1.選取了來自天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院2013-2014年間乳腺腫瘤科82例乳腺癌病人的癌和癌旁組織,通過免疫組
2、化和組織蛋白Western blot分析乳腺癌的癌組織和癌旁組織中 PKM2表達(dá)情況。并通過乳腺病理資料的分析研究乳腺癌組織PKM2與EGFR和HER2表達(dá)的相關(guān)性。
2.選取MDA-MB-231和SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞系,通過Western blot分析乳腺癌細(xì)胞系中PKM2表達(dá)情況,以及EGFR和HER2表達(dá)情況。選取高表達(dá)EGFR的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231,利用siRNA對(duì)MDA-MB-231進(jìn)行EGFR基因沉
3、默,通過Western blot檢測(cè) EGFR基因沉默對(duì)MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞系PKM2表達(dá)的影響。選取高表達(dá)HER2的乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3,利用siRNA對(duì)SK-BR-3進(jìn)行HER2基因沉默,通過Western blot檢測(cè) HER2基因沉默對(duì)SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞系中PKM2表達(dá)的影響。
3.選取高表達(dá)EGFR的MDA-MB-231和高表達(dá)HER2的SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞系。通過 Western blot
4、和 RT-PCR分析拉帕替尼對(duì) PKM2表達(dá)的影響。選取MDA-MB-231和SK-BR-3兩個(gè)乳腺癌細(xì)胞系,每個(gè)細(xì)胞系均分成兩組:拉帕替尼處理組和DMSO處理組。對(duì)每組細(xì)胞進(jìn)行EGF刺激,通過Western blot檢測(cè)EGF刺激24h和48h對(duì)各組細(xì)胞PKM2表達(dá)和Tyr-105磷酸化的影響;通過RT-PCR檢測(cè)EGF刺激24h對(duì)各組細(xì)胞PKM2表達(dá)的影響。選取120例經(jīng)免疫組化分析HER2(+++)或者經(jīng)FISH檢測(cè)提示HER2基
5、因擴(kuò)增的晚期轉(zhuǎn)移性乳腺癌病人。將120乳腺癌病人分成兩組:放化療加拉帕替尼治療組和單純放化療的對(duì)照組。通過 ELISA法分析這些病人經(jīng)拉帕替尼治療后血清中PKM2水平變化。
4.選取 MDA-MB-231和SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞系,每個(gè)細(xì)胞系分成三組:拉帕替尼處理組,DMSO處理組,未處理組,用CCK8實(shí)驗(yàn)測(cè)定每個(gè)細(xì)胞系中各組細(xì)胞的增殖曲線,來觀察拉帕替尼對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖作用的影響。建立PKM2過表達(dá)的乳腺癌穩(wěn)定細(xì)胞系,經(jīng)拉
6、帕替尼處理后通過CCK8實(shí)驗(yàn)測(cè)定過表達(dá)PKM2的乳腺癌細(xì)胞系細(xì)胞增殖曲線較比對(duì)照組有無變化。
5.用siRNA對(duì)MDA-MB-231和SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞系進(jìn)行PKM2的基因沉默,利用Western blot分析PKM2基因沉默的細(xì)胞系中與細(xì)胞增殖有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Stat3和 Tyr-705磷酸化 Stat3表達(dá)量較比對(duì)照組的變化。選取 MDA-MB-231和SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞系進(jìn)行了拉帕替尼處理實(shí)驗(yàn)。每個(gè)細(xì)胞系設(shè)置三
7、個(gè)組:拉帕替尼處理組、DMSO處理組、未處理組。通過Western blot分析拉帕替尼處理組Stat3和Stat3(Tyr(P)-705)的表達(dá)量較比對(duì)照組的變化。
結(jié)果:
1.乳腺癌免疫組化分析和乳腺癌組織蛋白Western blot測(cè)定,以及對(duì)乳腺癌病理資料的分析結(jié)果表明:PKM2在乳腺癌組織中表達(dá)量比正常癌旁組織有顯著增加;乳腺癌組織病理資料通過卡方檢驗(yàn)進(jìn)行分析,結(jié)果顯示在乳腺癌組織中PKM2與HER2之間存
8、在著正向的相關(guān)性,PKM2與EGFR之間存在著正向的相關(guān)性;利用siRNA對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231的EGFR進(jìn)行基因沉默,結(jié)果顯示:MDA-MB-231細(xì)胞基因沉默后PKM2表達(dá)量較比對(duì)照組顯著降低;利用siRNA對(duì)乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3的HER2進(jìn)行基因沉默,結(jié)果顯示:SK-BR-3細(xì)胞基因沉默后PKM2表達(dá)量較比對(duì)照組顯著降低。
2. EGF刺激相同時(shí)間時(shí),經(jīng)拉帕替尼處理的細(xì)胞系中PKM2的表達(dá)量比DMSO處
9、理組顯著降低。在拉帕替尼處理組中,EGF刺激對(duì)PKM2表達(dá)量的影響不大;而在DMSO處理組,EGF刺激后PKM2表達(dá)量較比未經(jīng)EGF刺激組有顯著增高。
3.通過ELISA法測(cè)定病人血清PKM2的水平,結(jié)果說明放化療加拉帕替尼治療的乳腺癌患者血清中PKM2的水平比單純放化療的乳腺癌患者血清PKM2的水平有顯著的降低。
4.將經(jīng)拉帕替尼處理的MDA-MB-231和SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞系通過CCK8實(shí)驗(yàn)繪制細(xì)胞增殖曲線
10、,結(jié)果顯示經(jīng)拉帕替尼處理的MDA-MB-231和SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞較比 DMSO處理組和未處理組增殖顯著減慢;PKM2過表達(dá)的MDA-MB-231和SK-BR-3乳腺癌穩(wěn)定細(xì)胞系經(jīng)拉帕替尼處理后,細(xì)胞增殖較比陰性對(duì)照組和野生型組明顯加快。
5.經(jīng)轉(zhuǎn)染PKM2 siRNA的MDA-MB-231和SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞系中Stat3和pStat3的表達(dá)量較比陰性對(duì)照組顯著降低;經(jīng)拉帕替尼處理的 MDA-MB-231和SK-
11、BR-3乳腺癌細(xì)胞系中PKM2的表達(dá)量較比對(duì)照組有顯著的降低;而且經(jīng)拉帕替尼處理的乳腺癌細(xì)胞系Stat3和pStat3的水平較比對(duì)照組也有顯著的降低。
結(jié)論:
1.乳腺癌中EGFR與PKM2,HER2與PKM2之間存在著正向的相關(guān)性。
2.拉帕替尼抑制乳腺癌中PKM2表達(dá)。
3.拉帕替尼通過影響PKM2表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞增殖。
4.拉帕替尼通過影響 PKM2的表達(dá)導(dǎo)致了細(xì)胞增殖相關(guān)的轉(zhuǎn)錄
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