家族性局灶節(jié)段性腎小球硬化癥臨床及致病基因研究.pdf

1、局灶節(jié)段性腎小球硬化癥(Focal segmental glomerularsclerosis，F(xiàn)SGS)是最常見的原發(fā)性腎小球腎炎之一。其特征為累及腎小球中部分毛細血管襻小葉的非炎癥性硬化和腎小球上皮細胞足突融合、消失。臨床表現(xiàn)為中到大量蛋白尿、浮腫、高血壓、腎功能不全。相當一部分FSGS患者對激素等藥物不敏感，腎功能進行性惡化至終末期腎功能衰竭。因此對其發(fā)病機制及治療的研究成為熱點。FSGS根據(jù)病因可分為原發(fā)性、繼發(fā)性及家族性/遺傳

2、性三類。其中家族性FSGS是指一個家族中有多人患病的情況，相對少見，且患者臨床表現(xiàn)缺乏特異性，因而對其認識不足，容易漏診。近年來通過對家族性FSGS的連鎖分析及定位克隆研究發(fā)現(xiàn)了NPHS1、NPHS2、ACTN4、TRPC6、PLCE1、INF2等數(shù)個致病基因，它們的編碼產(chǎn)物均表達在腎小球足細胞上，表明足細胞損傷在家族性FSGS發(fā)病中起到關(guān)鍵作用。對上述足細胞分子的研究還發(fā)現(xiàn)它們在原發(fā)性FSGS發(fā)病中也有重要作用，為全面理解FSGS致病

3、機理提供了重要幫助。但目前已發(fā)現(xiàn)的致病基因僅能解釋少數(shù)家族性FSGS的病因，相當一部分家系致病基因尚不明確。因此對家族性FSGS的臨床特點總結(jié)及對致病基因篩查與功能研究，可提高對該疾病的臨床及發(fā)病機理的認識。而對合適的家系進行連鎖分析及定位克隆，將有希望發(fā)現(xiàn)新的致病基因。目前國際上有關(guān)于家族性FSGS的家系報道及單個基因篩查與功能研究的報道，但國內(nèi)外尚無對多個FSGS家系從臨床到致病基因篩查、功能研究再到新致病基因定位的系列研究。

4、>　　 本研究第一部分對瑞金醫(yī)院自1997年9月到2009年6月收集的共47個FSGS家系及其106名患者進行臨床特點總結(jié)，并選取同期150例散發(fā)性FSGS患者作為對照。發(fā)現(xiàn)家族性FSGS患者的臨床表現(xiàn)與散發(fā)性FSGS患者相似，但激素及免疫抑制劑療效差。對其中的16個家系先證者篩查TRPC6、ACTN4和NPHS2的基因突變，100例正常人作為對照。發(fā)現(xiàn)TRPC6基因SNP7個，ACTN4基因SNP10個，NPHS2基因SNP7個。并

5、根據(jù)家族性FSGS患者的臨床特點及基因檢測結(jié)果建立完善了對該病的臨床診治及基因篩查體系。
　　 本研究第二部分對先前發(fā)現(xiàn)的ACTN4 L316P突變進行深入功能研究。采用定點誘變構(gòu)建成功含有L316P突變和K255E突變(陽性對照)的ACTN4-fl-GFP-N1質(zhì)粒，將野生型及突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人足細胞，應(yīng)用免疫熒光法及共聚焦顯微鏡觀察α-actinin-4在細胞內(nèi)的定位及足細胞骨架蛋白F-actin的表達情況。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染

6、ACTN4 K255E和L316P突變質(zhì)粒后，α-actinin-4在足細胞內(nèi)的定位明顯改變：野生型α-actinin-4均勻表達于足細胞胞漿中，K255E突變型α-actinin-4聚集在細胞核周圍，而L316P突變型α-actinin-4則主要分布在胞漿內(nèi)近胞膜處。轉(zhuǎn)染了L316P突變的足細胞內(nèi)細胞骨架蛋白F-actin表達減弱，正常的絲狀結(jié)構(gòu)遭破壞。
　　 本研究第三部分對一個累及四代的FSGS家系進行了新致病基因的探索。

7、家系調(diào)查后對78名成員進行仔細臨床檢查，明確家系臨床特征及遺傳方式。在先證者中對可能的已知致病基因NPHS2、ACTN4和TRPC6進行PCR擴增、測序排除致病突變。再以單核苷酸多態(tài)性(SNP)芯片為標記對該家系關(guān)鍵成員進行全基因組掃描，采用Merlin和SimWalk2軟件，分別以參數(shù)法和非參數(shù)法連鎖分析對該家系的致病基因進行了定位研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該家系符合常染色體顯性遺傳規(guī)律，遲發(fā)起病，患者11名。先證者NPHS2，ACTN4和TRP

8、C6基因篩查未發(fā)現(xiàn)致病突變。芯片數(shù)據(jù)分析計算后發(fā)現(xiàn)在rs1431213處獲得最大優(yōu)勢對數(shù)(LOD)值3.795，進一步單倍型分析將該家系的致病基因定位于6號染色體長臂1區(qū)6帶至2區(qū)2帶之間(6q16～22)約5Mb的范圍內(nèi)，為一新的致病基因連鎖區(qū)域。
　　 綜上所述，家族性FSGS患者的臨床表現(xiàn)與散發(fā)性患者相似，但其治療效果差。對16個家系先證者的篩查中，發(fā)現(xiàn)了NPHS2、TRPC6和NPHS2基因的數(shù)個SNP。根據(jù)患者的臨床表