蛋氨酸腦啡肽對(duì)小鼠樹突狀細(xì)胞分化誘導(dǎo)和功能調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　 通過(guò)蛋氨酸腦啡肽(MENK)在體內(nèi)外對(duì)小鼠骨髓來(lái)源樹突狀細(xì)胞(DC)亞群分化的誘導(dǎo),樹突狀細(xì)胞免疫表型、生物學(xué)活性、抗原提呈功能的調(diào)控,從而探討MENK調(diào)控鼠骨髓來(lái)源樹突狀細(xì)胞分化、誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答及抗腫瘤的作用的機(jī)制。為進(jìn)一步發(fā)掘DCs的免疫潛能,使其在抗腫瘤反應(yīng)中發(fā)揮最大作用奠定基礎(chǔ),繼而為腫瘤的治療提供廣闊的前景。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 首先,研究蛋氨酸腦啡肽對(duì)小鼠樹突狀細(xì)胞亞型分化

2、的誘導(dǎo)及調(diào)控。從7-8周齡的C57BL/6小鼠骨髓提取骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng),經(jīng)CD11c免疫磁珠分選,獲得純化的樹突狀細(xì)胞。流式細(xì)胞儀分析表明,CD11c(樹突狀細(xì)胞的特異性標(biāo)記)陽(yáng)性細(xì)胞純度達(dá)85%以上。采用倒置熒光顯微鏡觀察不同濃度的(10-8-10-14mol/L)MENK體外誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞的形態(tài)變化,采用流式細(xì)胞儀分析梯度濃度的MENK體外誘導(dǎo)骨髓樹突狀細(xì)胞前體后其CD11c+CD11b+DC和CD11c+CD11b'CD45R/

3、B220+DC亞群的變化規(guī)律和固定量的MENK(20mg/kg注射量)體內(nèi)誘導(dǎo)DC亞群分化的特點(diǎn),以及體內(nèi)外共刺激分子CD80,CD40和MHC-Ⅱ分子的表達(dá)進(jìn)而確定MENK體外最佳誘導(dǎo)濃度。其次,研究蛋氨酸腦啡肽對(duì)樹突狀狀細(xì)胞免疫學(xué)功能的調(diào)控。用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法,檢測(cè)了不同體外誘導(dǎo)條件下,各組骨髓樹突狀細(xì)胞前體來(lái)源的樹突狀細(xì)胞上清中的IL-12p70和IL-10含量,進(jìn)而從誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的特點(diǎn)判斷MENK對(duì)T

4、h1/Th2型反應(yīng)的定向調(diào)控;同時(shí)用RT-PCR的方法檢測(cè)了各組誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞其κ,δ,μ阿片受體及細(xì)胞內(nèi)TNF-α和TLR-4的mRNA水平;在誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)的條件下,用MTr法測(cè)定了T淋巴細(xì)胞的增殖能力;采用MTT法配合倒置熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定了10-12mol/LMENK(MENK-12),LPS,IL-3,G+I誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞的對(duì)MCF-7腫瘤細(xì)胞的抑制率及體外凋亡的情況;同時(shí)采用Tweste

5、rn-Blot檢測(cè)了體外誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞凋亡蛋白TRAIL蛋白的分泌情況。在體內(nèi)試驗(yàn)中,制備了荷瘤鼠模型,在MENK(20mg/kg注射量)的作用下,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了體內(nèi)樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)腫瘤凋亡的能力并比較了小鼠的生存率、抑瘤率;同時(shí)將用MENK-12體外誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞進(jìn)行了體內(nèi)回輸檢測(cè)其生存率、抑瘤率。最后,在MENK對(duì)樹突狀細(xì)胞亞群分化誘導(dǎo)及免疫學(xué)功能調(diào)控的的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討了MENK對(duì)樹突狀細(xì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路TLR-4-NF-κ

6、b信號(hào)活化的意義。用Westen-Blot的方法,定量檢測(cè)了MENK對(duì)樹突狀細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白NF-κb和TLR-4的表達(dá)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1、在樹突狀細(xì)胞亞群分化方面,無(wú)論是在體內(nèi)還是在體外,MENK均定向的誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞像髓系發(fā)展,在體外誘導(dǎo)中,在MENK濃度為10-12mol/L的時(shí),共刺激分子CD80,CD40,MHCⅡ達(dá)到最高值,表明MENK是最佳誘導(dǎo)濃度是10-12mol/L。
　　

7、2、ELISA結(jié)果表明MENK-12(10-12mol/LMENK)誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞分泌的IL-12p70的含量高于IL-10,表明MENK-12能夠定向誘導(dǎo)TH1型反應(yīng),RT-PCR的結(jié)果表明,經(jīng)MENK-12誘導(dǎo)的的樹突狀細(xì)胞能夠上調(diào)阿片受體及細(xì)胞內(nèi)TNF-α和TLR-4的mRNA水平。Western-Blot檢測(cè)結(jié)果證實(shí)了MENK-12增加了樹突狀細(xì)胞分泌TRAIL蛋白的的能力。MTT結(jié)果表明MENK-12能夠刺激樹突狀細(xì)胞刺激同種

8、異體T淋巴細(xì)胞的增殖能力,流式結(jié)果表明MENK在體內(nèi)外均能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡壞死并可以顯著抑制荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng),延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存時(shí)間,其生存率明顯高于模型對(duì)照組。
　　 3、Western-Blot結(jié)果表明MENK-12能夠上調(diào)骨髓樹突狀細(xì)胞前體來(lái)源的樹突狀細(xì)胞TLR-4的表達(dá),從而活化TNF-κb信號(hào)通路。
　　 結(jié)論:
　　 1、MENK能夠在體內(nèi)外誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞向髓系分化,并且上調(diào)共刺激分子的表達(dá)。