羅格列酮對HaCcT細(xì)胞體外增殖、分化、凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制的實驗研究.pdf

1、目的：研究羅格列酮對角質(zhì)形成細(xì)胞體外增殖、分化及凋亡的影響，并探討其可能機(jī)制，為羅格列酮臨床治療銀屑病提供實驗和理論依據(jù)。
　　 方法：以永生化人角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞為銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞模型。采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測不同濃度羅格列酮作用于HaCaT細(xì)胞24h、48h、72h、96h后對HaCaT細(xì)胞體外增殖的抑制作用；半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)測定不同濃度羅格列酮對HaCaT細(xì)胞分化標(biāo)志物外皮蛋

2、白，轉(zhuǎn)谷胺酰胺酶1mRNA表達(dá)水平的影響；Hoechst33258熒光染色法觀察羅格列酮誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化；免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測HaCaT細(xì)胞中PPARγ蛋白表達(dá)；Western blot方法測定羅格列酮處理HaCaT細(xì)胞后β-catenin和Cyclin D1的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：1.MTT法檢測結(jié)果表明10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L的羅格列酮作用48h后，對HaCa

3、T細(xì)胞體外增殖的抑制率分別為18.9％、23.7％、35.1％、44.6％，與溶媒組相比差異有顯著意義(P＜0.05)。實驗結(jié)果顯示羅格列酮對HaCaT細(xì)胞體外增殖的抑制作用與羅格列酮濃度呈明顯的劑量依賴關(guān)系。2.RT-PCR檢測結(jié)果表明10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L的羅格列酮作用48h后，HaCaT細(xì)胞外皮蛋白與β-actin的熒光強(qiáng)度比值分別為：0.530±0.049、0.638士0.052、

4、0.975士0.028、1.540士0.060，轉(zhuǎn)谷胺酰胺酶1與β-actin的比值分別為：0.598士0.011、0.817±0.006、1.278±0.083、1.777±0.027，與溶媒組相比差異有顯著意義（P＜0.05），表明羅格列酮可上調(diào)HaCaT細(xì)胞分化標(biāo)志物外皮蛋白，轉(zhuǎn)谷胺酰胺酶1mRNA的表達(dá)，且外皮蛋白，轉(zhuǎn)谷胺酰胺酶1mRNA的表達(dá)隨羅格列酮濃度的增高而增強(qiáng)。3.Hoechst33258熒光染色顯示羅格列酮處理HaC

5、aT細(xì)胞48h后，可見細(xì)胞核染色質(zhì)凝聚、邊集、核裂解的形態(tài)學(xué)改變，而對照組無明顯變化。4，免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示HaCaT細(xì)胞PPARγ蛋白呈陽性表達(dá)，并分布在細(xì)胞核及核周。5.Western blot檢測結(jié)果顯示10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L的羅格列酮處理HaCaT細(xì)胞48h后，β-catenin/β-actin灰度值比值分別為0.744±0.046、0.575±0.012、0.373±0.011

6、、0.228±0.015,CyclinD1/β-actin灰度值比值分別為0.746±0.081、0.601±0.063、0.462±0.033、0.301±0.061，與對照組相比差異有顯著意義(P＜0.01），結(jié)果表明羅格列酮能顯著下調(diào)β-catenin和Cyclin D1的表達(dá)。
　　 結(jié)論：1．羅格列酮能夠顯著抑制人角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞體外增殖、促進(jìn)分化、誘導(dǎo)凋亡。2．羅格列酮作用HaCaT細(xì)胞后，可能通過下調(diào)β