NF-κB抑制劑PDTC對(duì)人牙髓干細(xì)胞定向分化影響及其分子機(jī)制的研究.pdf

1、齲病是被 WHO列為當(dāng)代危害人類健康非傳染性疾病之一。牙齲壞后，牙本質(zhì)小管內(nèi)細(xì)菌可導(dǎo)致牙髓組織感染或者發(fā)炎。此時(shí)牙髓組織中的可分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞，成骨細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞的多能干細(xì)胞--牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cells，DPSCs）遷移分化成為有功能的成牙本質(zhì)樣細(xì)胞（odontoblast-like cells，OBLCs），保護(hù)牙髓。
　　研究表明，NF-κB信號(hào)通路在調(diào)節(jié)干細(xì)胞分化方面有重要作用，如炎癥因子T

2、NF、IL-17作用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞激活I(lǐng)KK-NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)降解β-catenin，進(jìn)而促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化；在牙髓干細(xì)胞分化方面，我們前期研究證明炎癥微環(huán)境下通過TLR4/MyD88/NF-кB信號(hào)通路促進(jìn)炎癥因子表達(dá)，PDTC作為NF-κB通路抑制劑，能夠抑制NF-κB參與炎癥環(huán)境下對(duì)干細(xì)胞分化的調(diào)控作用，減輕炎癥反應(yīng)。
　　吡咯烷二硫基甲酸(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC

3、)是一種穩(wěn)定的化合物，氨基甲酸鹽的一種，并且被廣泛用作NF-κB通路的抑制劑，文獻(xiàn)報(bào)道，PDTC在干細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用，如體外大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在LPS刺激下，激活NF-κB信號(hào)通路，RT-PCR檢測(cè)得出炎癥環(huán)境下即LPS處理后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞抗炎因子IL-10和TGF-β3表達(dá)升高，當(dāng)PDTC作用于大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞后，抗炎因子的表達(dá)受到抑制，表明PDTC參與炎癥環(huán)境下細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)；PDTC阻斷NF-κB通路后下調(diào)Smad信號(hào)

4、通路可以促進(jìn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化；而在脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞中，PDTC抑制NF-κB通路促進(jìn)TAZ的表達(dá)來抑制脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨向分化。那么PDTC對(duì)炎癥狀態(tài)下牙髓干細(xì)胞分化是否有積極影響以及作用機(jī)制還不清楚。本研究通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)研究NF-κB抑制劑PDTC對(duì)牙髓干細(xì)胞成牙/成骨分化能力的影響，以探討PDTC在牙髓干細(xì)胞分化中的作用，對(duì)牙髓損傷修復(fù)時(shí)hDPSCs定向分化機(jī)制有重要意義。
　　主要的研究

5、結(jié)果如下：
　　1．hDPSCs分離、培養(yǎng)和鑒定
　　我們使用組織塊酶消化方法，成功分離培養(yǎng)人牙髓原代細(xì)胞，然后應(yīng)用有限稀釋法，分離培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞，取三代細(xì)胞運(yùn)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞表面抗原檢測(cè)和鑒定，并且體外分別礦化誘導(dǎo)2周、成脂誘導(dǎo)3周對(duì)細(xì)胞多向分化能力進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明我們分離并培養(yǎng)的牙髓干細(xì)胞符合間充質(zhì)干細(xì)胞相應(yīng)的分子生物學(xué)特點(diǎn)，證明成功建立了hDPSCs細(xì)胞系。
　　2．PDTC對(duì)hDPSCs增殖能力的影響

6、
　　配制不同濃度PDTC刺激液，通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度PDTC刺激液（2-200μmol/L）對(duì)hDPSCs增殖能力的影響。結(jié)果表明，200μmol/L PDTC可明顯抑制該細(xì)胞的增殖能力，對(duì)hDPSCs有毒性作用，而其余2μmol/L、20μmol/L兩組濃度PDTC刺激液與對(duì)照組相比，抑制hDPSCs增殖能力，但組間無明顯的差異。
　　3．PDTC對(duì)體外二維、三維環(huán)境培養(yǎng)hDPSCs定向分化的影響
　　首先二

7、維培養(yǎng)環(huán)境下用2μmol/L、20μmol/L PDTC刺激液分別礦化誘導(dǎo)hDPSCs2周，通過茜素紅染色及定量實(shí)驗(yàn)表明，與對(duì)照組相比20μmol/L PDTC組礦化結(jié)節(jié)表達(dá)明顯高于對(duì)照組，以上證明20μmol/L PDTC能有效地促進(jìn)hDPSCs的成牙/成骨分化。
　　其次體外將hDPSCs接種于多孔納米纖維結(jié)構(gòu)明膠復(fù)合支架，為hDPSCs提供三維生長(zhǎng)環(huán)境，然后配制濃度為2μmol/L、20μmol/L PDTC刺激液，對(duì)照組為

8、10％ FBS培養(yǎng)液，通過MTT測(cè)定刺激組和對(duì)照組1、3、5、7天490nm吸光度值，結(jié)果表明，2μmol/L、20μmol/L PDTC抑制細(xì)胞增殖能力；再次，配制2μmol/L、20μmol/L PDTC刺激液，礦化誘導(dǎo)2周，通過茜素紅染色及定量結(jié)果與礦化組比較表明20μmol/L PDTC刺激組促進(jìn)hDPSCs成骨分化，結(jié)果證明PDTC促進(jìn)體外三維培養(yǎng)環(huán)境下hDPSCs成牙/成骨分化。
　　4．體內(nèi)裸鼠實(shí)驗(yàn)觀察PDTC對(duì)hD

9、PSCs定向分化的影響
　　本實(shí)驗(yàn)通過將預(yù)先用20μmol/L PDTC礦化誘導(dǎo)的hDPSCs接種于納米明膠支架材料，并觀察6周后取材，HE染色、Masson染色、Von Kossa染色、X線平片結(jié)果及Micro-CT三維重建及數(shù)據(jù)分析來觀察PDTC對(duì)hDPSCs成牙/成骨向分化的影響，結(jié)果表明，20μmol/L PDTC促進(jìn)hDPSCs成牙/成骨向分化。
　　5．研究PDTC對(duì)hDPSCs定向分化影響機(jī)制
　　通過茜

10、素紅染色及定量實(shí)驗(yàn)和Western blot技術(shù)，初步探討PDTC調(diào)控hDPSCs定向分化機(jī)制。結(jié)果證明PDTC刺激組和對(duì)照組比較p-p65蛋白表達(dá)降低，表明NF-κ hDPSCs成牙/成骨分化調(diào)節(jié)；ERK通路抑制劑（U0126）明顯抑制PDTC誘導(dǎo)hDPSCs礦化結(jié)節(jié)的形成，MAPK（JNK、p38）抑制劑（SP600125、SB203580）抑制相應(yīng)通路后，PDTC對(duì)hDPSCs成牙/成骨分化作用不受影響，即JNK、p38通路不參與