左旋丁基苯酞抑制氧糖剝奪-復氧后小鼠腦膠質(zhì)細胞內(nèi)NF-κB的激活及機制.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、腦缺血后神經(jīng)功能的最終恢復不僅有賴于對神經(jīng)元和灰質(zhì)的保護,而且也有賴于對白質(zhì)的保護。而膠質(zhì)細胞作為腦白質(zhì)的主要組成細胞,深入研究其缺血性損傷的機制及抑制手段就顯得尤為必要和重要。 膠質(zhì)細胞對炎癥、外傷等損傷具有反應性增生的能力,即膠質(zhì)細胞數(shù)目增加,細胞增殖、肥大,較正常時出現(xiàn)更多的膠質(zhì)絲和突起,代謝活動增強。增生的膠質(zhì)細胞及其突起可以包圍受損、變性的神經(jīng)元,過度的膠質(zhì)化可阻礙髓鞘和軸突的再生,影響周圍神經(jīng)組織的結(jié)構(gòu)修復和功能恢復

2、。增生膠質(zhì)細胞形成的膠質(zhì)瘢痕甚至還可能成為腦缺血后繼發(fā)性癲癇病灶。目前對腦缺血/再灌注損傷機制的研究,主要集中在細胞內(nèi)鈣超載、興奮性毒性氨基酸、氧自由基損傷、炎癥反應、細胞凋亡調(diào)控基因、胱冬酶家族基因、即早反應基因等方面。其中,缺血/再灌注后炎癥反應促進了繼發(fā)性腦損害,是腦缺血/再灌注損傷的主要原因之一。而膠質(zhì)細胞的反應性增生也與炎癥反應中分泌的細胞因子IL-1β、TGF、NGF等有關(guān)。因此,關(guān)注膠質(zhì)細胞在腦缺血后的炎癥反應及與之相關(guān)的

3、抗炎、神經(jīng)保護途徑將對缺血性腦卒中的治療和后期康復具有重要而現(xiàn)實的意義。 核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)是一種重要的細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子,其主導調(diào)節(jié)一系列與炎癥相關(guān)的細胞因子、酶類等的轉(zhuǎn)錄和表達,介導或直接參與了腦缺血/再灌注后神經(jīng)元的損傷、死亡。多數(shù)學者認為NF-κB在炎癥反應和免疫應答中具有重要、關(guān)鍵的地位,是炎癥反應的中心環(huán)節(jié)。它已成為干預腦缺血/再灌注損傷有前景的治療靶點之一。

4、 丁基苯酞(3-n-butylphthalide,NBP)是我國第3種化學合成類I類新藥,亦是中國腦血管研究領(lǐng)域第1項擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的國家I類新藥。它主要從我國南方水芹籽中提取得到,包括三種光學異構(gòu)體:左旋丁基苯酞(1-NBP)、右旋丁基苯酞(d-NBP)、消旋丁基苯酞(dl-NBP),其中1-NBP的藥效學作用更強。經(jīng)大量實驗室研究證明丁基苯酞對缺血后神經(jīng)元具有保護作用,多中心I-IV期臨床實驗研究也表明,1-NBP對急性缺血性腦

5、卒中有明顯療效,具有良好的抗腦缺血活性。因此,我們以1-NBP為干預藥物,進一步研究其對膠質(zhì)細胞氧糖剝奪/復氧后炎性損傷的抑制作用及對膠質(zhì)細胞反應性增生的抑制作用,并探討其可能機制;明確1-NBP對缺血/再灌注后腦膠質(zhì)細胞的保護作用;推測其可能對膠質(zhì)瘢痕的形成具有一定的抑制作用;預測其可能對其它白質(zhì)炎癥相關(guān)性疾病(多發(fā)性硬化、CNS創(chuàng)傷、C NS感染等)具有一定的治療或輔助治療作用。 目的:(1)探討小鼠腦膠質(zhì)細胞(glial

6、cell,GC)的培養(yǎng)方法并對之進行形態(tài)學觀察,免疫細胞化學鑒定。 (2)通過體外細胞氧糖剝奪/復氧(oxygen glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)模型研究GC在OGD/R不同時間段細胞數(shù)量、活性的變化情況及細胞內(nèi)NF-κB p65蛋白表達、活化的規(guī)律。 (3)研究1-NBP對GC在OGD24h/Rl d后細胞數(shù)量變化的影響。 (4)研究1-NBP對OGD24h/R

7、ld后GC內(nèi)IκB-α、NF-κB p65、IL-1β蛋白表達的影響。 方法:取昆明小鼠乳鼠腦組織,采用機械吹打分離、篩網(wǎng)過濾、離心等技術(shù)獲取鼠腦膠質(zhì)細胞并進行培養(yǎng),通過倒置顯微鏡、免疫細胞化學進一步鑒定;采用LDH法、免疫細胞化學方法研究和評價OGD/R模型,用MTT法確定GC數(shù)量變化最大的OGD/R時間點;采用Western blot、ELISA方法研究藥物1-NBP作用下OGD/R后GC內(nèi)IκB-α、NF-κB p65以及

8、其下游炎性細胞因子IL-1β蛋白表達情況。 結(jié)果:(1)經(jīng)形態(tài)學、免疫細胞化學(GFAP、MAC-1、NSE)鑒定所培養(yǎng)的細胞為混合培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞。 (2)OGD前后細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化顯著,LDH釋放量增加,并與NC組相比有顯著性差異(p<0.01)。 (3)免疫細胞化學顯示OGD后細胞核內(nèi)蛋白表達增加;OGD4h時開始明顯增加,OGD12h時達到高峰,OGD24h時有所下降,但仍高于NC組;OGD

9、12h與OGD24h相比無顯著性差異(p>0.05);OGD各組與NC組相比均有顯著性差異(p<0.01)。OGD前NF-κB p65弱陽性表達,多在胞漿中可見;OGD后NF-κB p65出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位,強陽性表達于胞核,細胞呈“實心”現(xiàn)象。 (4)MTT法測定發(fā)現(xiàn)OGD24h后細胞數(shù)量減少,與NC組和OGD24h/R各組相比均有顯著性差異(p<0.05):OGD24h/R8h、OGD24h/R12h、OGD24h/Rld、OGD2

10、4h/R2d、OGD24h/R3d各時間段GC數(shù)量逐漸增加,OGD24h/R1d、OGD24h/R2d、OGD24h/R3d與NC組相比有顯著性差異(p<0.05)。 (5)MTT法測定發(fā)現(xiàn)正常培養(yǎng)時I-NBP各組(20μmol/L、100μmol/L、500μmol/L)細胞數(shù)量與NC組無統(tǒng)計學差異(p>0.05)。1-NBP 1mmol/L組細胞數(shù)量增多,與NC組相比有顯著性差異(p<0.01)。PDTC 1 00μmol/

11、L組細胞數(shù)量減少,與NC組相比有顯著性差異(p<0.01)。OGD24h/Rld后細胞數(shù)量增加,1-NBP各組(20μmol/L、1 00μmol/L、500pmol/L)、PDTC 1 00μmol/L組細胞數(shù)量減少,PDTC100μmol/L組與1-NBP各組相比均有顯著性差異(p<0.05)。1-NBP500μmol/L組與20μmol/L、100μmol/組組間比較差異顯著(p<0.05)。 (6)Western blo

12、t條帶顯示,OGD24h/Rld后核內(nèi)NF-κB p65蛋白表達增加,與NC組相比有顯著差異(p<0.01);1-NBP各組(20μmol/L、100μmol/L、500μmol/L)NF-κd3 p65蛋白表達減少,I-NBP濃度越高NF-κB p65蛋白表達越少,1-NBP 100μmol/L組、1-NBP 500μmol/L組與OGD24h/R1d組相比有顯著差異(p<0.01)。PDTC 100μmol/L組NF-κBp65蛋白

13、表達也減少,與OGD24h/RId組比較有顯著差異(p<0.01)。1-NBP 500μmol/L組與20μmol/L、1 00μmol/組組間比較差異顯著(p<0.05)。 (7)Western Blot條帶顯示,OGD24h/Rld后胞漿內(nèi)IκB-α[蛋白表達減少,與NC組相比有顯著差異(p<0.01);1-NBP各組(20μmol/L、1 00μmol/L、500μmol/L)IκB-α蛋白表達增加,1-NBP濃度越高Iκ

14、B-α蛋白表達越多,1-Nq3P 100μmol/L、500μmol/L組與OGD24h/Rld組相比有顯著差異(p<0.01)。PDTC 100μmol/L組IκB-α蛋白表達也增加,與OGD24h/Rld組比較有顯著差異(p<0.01)。1-NBP 500μmol/L組與20μmol/L、100μmol/組組間比較差異顯著(p<0.05)。 (8)ELISA測定發(fā)現(xiàn),OGD24h/Rld后IL-1β分泌量增加,與NC組相比有

15、顯著差異(p<0.05);1-NBP各組(20μmol/L、1 00μmol/L、500μmol/L)IL-1β表達減少,1-NBP濃度越高IL-1β表達越少,1-NBP100μmol/L組、1-NBP 500μmol/L組與NC組比較無明顯差異(p>0.05)。PDTC 100μmol/L組IL-1β表達也減少,與各組比較均有顯著差異(p<0.01)。 結(jié)論:(1)成功進行了小鼠腦星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的混合原代培養(yǎng)及鑒定。

16、 (2)對正常培養(yǎng)GC,1-NBP各濃度組(20μmol/L、100μmol/L、500μmol/L)無明顯促進生長作用。1-NBP 1mmol/L組有促進細胞生長作用,PDTC 100μmol/L組有抑制細胞生長作用。表明1-NBP對GC沒有毒副作用;PDTC對GC可能有一定毒性作用。 (3)體外細胞OGD/R模型簡便有效,OGD后GC數(shù)量減少、活性減弱,NF-κB因子活化入核,OGD12h為其表達高峰。 (4

17、)OGD24h/R1d后GC出現(xiàn)反應性增生。1-NBP和PDTC均能抑制細胞數(shù)量的增加,1-NBP 500μmol/L組抑制作用較其低濃度組(201μmol/L、100μmol/L)明顯。 (5)OGD24h/Rld后GC內(nèi)IκB-α蛋白降解,NF-κB p65活化入核,1-NBP能通過抑制IκB-α在胞漿的降解來減少NF-κB p65入核。1-NBP500μmol/L組抑制作用較其低濃度組(20μmol/L、100μmol/L

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