活性氧介導2-ME誘導人神經(jīng)母細胞瘤SK-N-SH凋亡的機制研究.pdf

1、背景與目的：神經(jīng)母細胞瘤(Neuroblastoma，NB)為兒童常見的顱外實體腫瘤之一。盡管傳統(tǒng)的治療手段對提高神經(jīng)母細胞瘤患兒的生存率已有一定程度的提高，但是兒童高危神經(jīng)母細胞瘤病人的治愈率仍不盡令人滿意。2.甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol，2-ME)是雌激素的天然代謝產(chǎn)物，對于多種腫瘤均顯示出良好的抗腫瘤活性。然而，2-ME對人神經(jīng)母細胞瘤(Neuroblastoma)的作用機制至今尚不清楚。本實驗旨在觀察2-

2、ME單獨和與臨床化療藥物聯(lián)合用藥對人神經(jīng)母細胞瘤SK-N-SH的作用并初步探討其機制。
　　 方法：Trypan blue法檢測SK-N-SH細胞8天內(nèi)的生長曲線。SRB法檢測不同濃度2-ME單獨和與臨床化療藥物聯(lián)合用藥對SK-N-SH細胞增殖的抑制作用以及VC、L-GSH以及靶向線粒體抗氧化劑MitoQ10對2-ME抑制SK-N-SH細胞增殖的影響。流式細胞術(shù)Annexin-V/FITC標記法檢測細胞周期分布情況。Hoechs

3、t33258熒光染色檢測細胞凋亡情況。利用熒光探針DCFH-DA檢測細胞內(nèi)的活性氧水平。Rhodamine123染色檢測線粒體膜電位的變化。Western blot來檢測2-ME處理過的SK-N-SH細胞Bcl-2、Bax和caspase-3，caspase-9，pERK蛋白的表達情況。
　　 結(jié)果：2-ME單獨應用對SK-N-SH細胞有明顯的生長抑制作用，同時2-ME與環(huán)磷酰胺，5-氟尿嘧啶，順鉑，阿霉素聯(lián)合用藥具有明顯的協(xié)同

4、作用(CI<1)，但2-ME與依托泊苷聯(lián)合用藥具有明顯拮抗作用(CI>1)，并且抑制效應在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴性。VC可以使2-ME抑制SK-N-SH增殖72h的IC50由1.88μM升高到3.75μM，加入L-GSH及MitoQ10后，2-ME作用72h的抑制率明顯降低，與2-ME相比有顯著差異(P<0.05)。流式細胞儀顯示2-ME將細胞周期阻滯于G2/M期。Hoechst33258熒光染色結(jié)果表明2-ME作用72h后細胞核致密濃染

5、，核縮小，凋亡率分別為47.32％，71.56％。DCFH-DA檢測結(jié)果表明細胞內(nèi)的活性氧顯著升高，MitoQ10阻斷2-ME引起的線粒體活性氧的升高。Rhodamine123染色表明2-ME作用72h細胞線粒體膜電位下降，而L-GSH，MitoQ10均能阻斷2-ME引起的線粒體膜電位的下降。Western blot檢測表明2-ME作用SK-N-SH細胞48h后，Bcl-2/Bax蛋白的比值表達下調(diào)，caspase-9，caspase-

6、3蛋白則表達上調(diào)，但是MitoQ10阻斷2-ME引起B(yǎng)cl-2/Bax和Caspase-9 caspase-3蛋白表達的變化。2-ME作用20min明顯抑制SK-N-SH細胞pERK蛋白水平，而MitoQ10并不阻斷2-ME引起的pERK蛋白水平的變化。
　　 結(jié)論：2-ME單獨和與臨床化療藥物聯(lián)合用藥均能能抑制人神經(jīng)母細胞瘤SK-N-SH增殖，2-ME誘導人神經(jīng)母細胞瘤的凋亡與線粒體內(nèi)ROS的積聚升高有關(guān)，同時我們發(fā)現(xiàn)2-ME