生酮飲食對新生期反復驚厥遠期神經行為損傷及發(fā)芽相關分子表達的影響.pdf

1、目的：探討生酮飲食對三氟乙醚所致新生期反復驚厥大鼠遠期神經行為損傷和海馬苔蘚纖維再生性發(fā)芽相關分子表達的影響。
　　方法：出生8天(Postnatal days8，用P8表示，下同)的Sprague-Dawley(SD)大鼠共48只，依據(jù)隨機數(shù)字表法隨機分為對照組（Non-seizure， NS組)和驚厥組(Recurrent-seizure，RS組)，每組各24只。適應性喂養(yǎng)一天后，RS組大鼠于P9吸入三氟乙醚誘導驚厥發(fā)作，反復

2、誘導驚厥持續(xù)30min，每日一次，同樣方法連續(xù)誘導8天；NS組同樣操作但不吸入三氟乙醚。于P28依據(jù)是否給予生酮飲食干預，每組大鼠依據(jù)隨機數(shù)字表法再隨機分為兩組，即單純對照組(NS+ND組)、對照加生酮飲食組(NS+KD組)、單純驚厥組(RS+ND組)、驚厥加生酮飲食組(RS+KD組)，每組各12只。NS+ND組和RS+ND組大鼠給予普通飲食（Normal diet，ND），NS+KD組和RS+KD組大鼠給予生酮飲食(Ketogenic

3、 diet，KD)，飲食干預四周。分別于P28、P35、P42、P49每組大鼠尾靜脈采血監(jiān)測其血糖值和血酮值。飲食干預期間(P28～P49)每隔三天測量并記錄各組大鼠的體重。于P35、P42、P49分別進行神經行為學評分（平面翻正實驗、前肢懸吊實驗、負向趨地反應實驗、懸崖回避實驗）。于P42、P49行曠場實驗測試大鼠的自主活動和情緒變化。于P50～P57行Morris水迷宮測試大鼠學習記憶功能。于P58每組各隨機取6只大鼠共24只，斷頭

4、取大腦皮質及海馬，采用免疫印跡技術（Western blot）檢測各組大鼠大腦皮質及海馬鋅離子轉運體3（Zn2+transporter3，ZnT3）、金屬硫蛋白3（Metallothionein-3，MT3）、載脂蛋白E(ApoE)、載脂蛋白J（ApoJ，又名叢生蛋白，Clusterin，CLU)、脂肪酰輔酶A:膽固醇?；D移酶1（Acyl-coenzyme A:cholesterol acyltransferase-1，ACAT-1）

5、的表達。同時每組隨機各取6只大鼠共24只，采用Neo-Timm染色法觀測海馬苔蘚纖維發(fā)芽的程度及分布情況。
　　結果：1.對體重的影響：生酮飲食干預前，驚厥組（RS組）P17～P27各時間點體質量較對照組（NS組）對應時間點明顯降低，差異具有顯著性（P＜0.01）；生酮飲食干預期間（P28～P49），四組大鼠的體重變化存在總體性差異，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。進一步組間兩兩比較結果顯示：與單純對照組（NS+ND組）各時間點相

6、比，對照組經生酮飲食干預后（NS+KD組）及單純驚厥組（RS+ND組）大鼠各對應時間點體重均顯著降低（P＜0.01）。于 P31～P49，驚厥組大鼠經生酮飲食干預后(RS+KD組)體重較單純驚厥組（RS+ND組）顯著降低（P＜0.01）。
　　2.神經發(fā)育指標：與單純對照組（NS+ND組）相比，單純驚厥組（RS+ND組）（P35、P42、P49）前肢懸吊時間、負向趨地反應時間和懸崖回避時間均明顯延長（P＜0.05），平面翻正時間（

7、P35、P42、P49）明顯縮短（P＜0.05）。與單純驚厥組（RS+ND組）比較，驚厥組大鼠經生酮飲食干預后(RS+KD組)（P35、P42、P49）前肢懸吊時間、負向趨地反應時間和懸崖回避時間均明顯縮短（P＜0.05），平面翻正時間（P35、P49）明顯延長（P＜0.05）。此外，與單純對照組（NS+ND組）相比，對照組經生酮飲食干預后（NS+KD組）（P35、P42、P49）前肢懸吊時間和負向趨地反應時間均明顯延長（P＜0.05）

8、。
　　3.曠場實驗：與單純對照組（NS+ND組）比較，單純驚厥組（RS+ND組）延遲時間（P42、P49）明顯延長（P＜0.05）、開場得分（P42、P49）明顯降低（P＜0.05）、修飾次數(shù)（P42、P49）明顯增多（P＜0.05）；而對照組經生酮飲食干預后（NS+KD組）延遲時間（P49）明顯延長（P＜0.05），修飾次數(shù)（P42）明顯增多（P＜0.05）。與單純驚厥組（RS+ND組）比較，驚厥組經生酮飲食干預后(RS+KD

9、組)延遲時間（P42、P49）明顯縮短（P＜0.05）、開場得分（P42、P49）明顯降低（P＜0.05）、修飾次數(shù)（P42、P49）明顯減少（P＜0.05）。
　　4.Morris水迷宮：⑴四組大鼠逃避潛伏期于測試第1天至第5天逐漸縮短，且于測試第1天至第5天，單純驚厥組（RS+ND組）逃避潛伏期較單純對照組（NS+ND組）明顯延長（P＜0.05）；于測試第4、5天驚厥組大鼠經生酮飲食干預后(RS+KD組)逃避潛伏期較單純驚厥組

10、（RS+ND組）明顯縮短（P＜0.05）。⑵單純驚厥組（RS+ND組）穿越平臺次數(shù)較單純對照組（NS+ND組）明顯減少（P＜0.05）；驚厥組大鼠經生酮飲食干預后(RS+KD組)穿越平臺次數(shù)較單純驚厥組（RS+ND組）明顯增多（P＜0.05）。
　　5.Neo-Timm染色結果顯示：單純驚厥組（RS+ND組）CA3區(qū)始層和齒狀回內分子層苔蘚纖維發(fā)芽程度較單純對照組（NS+ND組）顯著升高（P＜0.01），而驚厥組大鼠經生酮飲食干預

11、后(RS+KD組) CA3區(qū)始層和齒狀回內分子層苔蘚纖維發(fā)芽程度較單純驚厥組（RS+ND組）明顯降低（P＜0.05）。
　　6.免疫印跡顯示：⑴鋅離子轉運信號通路：與單純對照組（NS+ND組）相比，單純驚厥組（RS+ND組）ZnT3、MT3大腦皮層的表達均明顯升高（P＜0.05），在海馬中的表達均顯著升高（P＜0.01）；而與單純驚厥組（RS+ND組）相比，驚厥組大鼠經生酮飲食干預后(RS+KD組) ZnT3、MT3在海馬和大腦皮

12、層的表達均明顯降低（P＜0.05）。單純對照組（NS+ND組）與對照組經生酮飲食干預后（NS+KD組）和驚厥組大鼠經生酮飲食干預后(RS+KD組)相比均無顯著性差異（P＞0.05）。⑵脂質代謝信號通路：與單純對照組（NS+ND組）相比，單純驚厥組（RS+ND組）ApoE和ACAT-1在海馬和大腦皮層的表達均顯著升高（P＜0.01），CLU在海馬和大腦皮層的表達均明顯升高（P＜0.05）；而與單純驚厥組（RS+ND組）相比，驚厥組大鼠經生

13、酮飲食干預后(RS+KD組) CLU和ACAT-1在海馬和大腦皮層的表達均明顯降低（P＜0.05），ApoE在海馬中表達顯著降低（P＜0.01）而在大腦皮層中表達明顯降低（P＜0.05）。單純對照組（NS+ND組）與對照組經生酮飲食干預后（NS+KD組）和驚厥組大鼠經生酮飲食干預后(RS+KD組)相比均無顯著性差異（P＞0.05）。
　　結論：1.三氟乙醚誘導新生期大鼠反復長程驚厥發(fā)作導致生長發(fā)育、神經行為及學習能力的損傷，造成海

14、馬CA3區(qū)始層及齒狀回內分子層苔蘚纖維異常發(fā)芽增強，并且這種改變可能與鋅離子轉運相關分子ZnT3、MT3及脂質代謝相關分子ApoE、CLU和ACAT-1在海馬及大腦皮質表達明顯上調有關。
　　2.驚厥后采用生酮飲食進行干預，能顯著改善大鼠的神經行為及認知損傷，且這種保護作用可能與鋅離子轉運相關分子ZnT3、MT3及脂質代謝相關分子ApoE、CLU和ACAT-1在海馬及大腦皮質表達明顯下調有關。
　　3.本研究表明，鋅離子轉運