小干擾RNA抑制HCV感染細(xì)胞中病毒復(fù)制的研究.pdf

1、研究目的：觀察siRNA對(duì)HCV感染細(xì)胞中病毒復(fù)制的抑制作用以及靶向HCV基因組不同區(qū)段的siRNA抗HCV的聯(lián)合效應(yīng)。
　　 研究方法：利用HCV全基因組質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄成RNA，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Huh-7.5.1細(xì)胞。收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞含病毒顆粒的上清培養(yǎng)液，感染正常Huh-7.5.1細(xì)胞以構(gòu)建HCV感染細(xì)胞模型，通過(guò)PCR-瓊脂糖凝膠電泳和Westernblot檢測(cè)感染細(xì)胞內(nèi)HCVRNA和HCV核心蛋白的表達(dá)。再用不同濃度的IFNα-2b

2、處理感染細(xì)胞，熒光定量PCR檢測(cè)處理后細(xì)胞內(nèi)HCVRNA相對(duì)量。設(shè)計(jì)針對(duì)HCV四個(gè)基因區(qū)段(Core、NS3、NS4B、NS5B)的siRNA序列，化學(xué)合成后分別以單用和兩兩組合的方式并以不同濃度(0.1nM，10nM，100nM)轉(zhuǎn)染HCV感染細(xì)胞，用PCR-瓊脂糖凝膠電泳和熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)HCV相對(duì)量。通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)PKRmRNA水平和CCK-8試驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞活性，進(jìn)而分析所用siRNA

3、的非特異性作用。
　　 研究結(jié)果：HCV感染細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到HCVRNA和HCV核心蛋白的表達(dá)，HCV可以被IFNα-2b有效抑制，抑制作用呈劑量依賴性。4種siRNA(siCore、siNS3、siNS4B、siNS5B)以10nM和100nM濃度單個(gè)轉(zhuǎn)染時(shí)，感染細(xì)胞內(nèi)HCV量與對(duì)照組相比均顯著下降(P<0.01)。在0.1nM和10nM濃度時(shí)，siCore、siNS3、siNS5B兩兩組合轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)HCV量相對(duì)任一單用組均明顯