小干擾RNA抑制HCV感染細胞中病毒復制的研究.pdf

1、研究目的：觀察siRNA對HCV感染細胞中病毒復制的抑制作用以及靶向HCV基因組不同區(qū)段的siRNA抗HCV的聯(lián)合效應。
　　 研究方法：利用HCV全基因組質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄成RNA，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Huh-7.5.1細胞。收集轉(zhuǎn)染細胞含病毒顆粒的上清培養(yǎng)液，感染正常Huh-7.5.1細胞以構(gòu)建HCV感染細胞模型，通過PCR-瓊脂糖凝膠電泳和Westernblot檢測感染細胞內(nèi)HCVRNA和HCV核心蛋白的表達。再用不同濃度的IFNα-2b

2、處理感染細胞，熒光定量PCR檢測處理后細胞內(nèi)HCVRNA相對量。設(shè)計針對HCV四個基因區(qū)段(Core、NS3、NS4B、NS5B)的siRNA序列，化學合成后分別以單用和兩兩組合的方式并以不同濃度(0.1nM，10nM，100nM)轉(zhuǎn)染HCV感染細胞，用PCR-瓊脂糖凝膠電泳和熒光定量PCR技術(shù)檢測各組細胞內(nèi)HCV相對量。通過熒光定量PCR檢測siRNA轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)PKRmRNA水平和CCK-8試驗檢測轉(zhuǎn)染細胞活性，進而分析所用siRNA

3、的非特異性作用。
　　 研究結(jié)果：HCV感染細胞內(nèi)檢測到HCVRNA和HCV核心蛋白的表達，HCV可以被IFNα-2b有效抑制，抑制作用呈劑量依賴性。4種siRNA(siCore、siNS3、siNS4B、siNS5B)以10nM和100nM濃度單個轉(zhuǎn)染時，感染細胞內(nèi)HCV量與對照組相比均顯著下降(P<0.01)。在0.1nM和10nM濃度時，siCore、siNS3、siNS5B兩兩組合轉(zhuǎn)染組細胞內(nèi)HCV量相對任一單用組均明顯