慢病毒載體介導(dǎo)的SOCS-3 RNA干擾對大鼠脂肪細(xì)胞代謝影響的實驗研究.pdf

1、肥胖(obesity)作為多種慢性疾病及惡性腫瘤的危險因素，已嚴(yán)重威脅著人類的身心健康。肥胖基因(ob gene)及其編碼產(chǎn)物瘦素(leptin)的發(fā)現(xiàn)，為肥胖在分子生物學(xué)水平的研究奠定了基礎(chǔ)。研究證實在大多數(shù)肥胖者和嚙齒類動物中存在著明顯的瘦素抵抗(leptin resitance，LR)，即對瘦素減少體重信號反應(yīng)能力降低。細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子-3(suppressor of cytokine signaling3，SOCS-3)

2、由瘦素誘導(dǎo)產(chǎn)生，是瘦素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)反饋抑制因子，通過抑制瘦素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用。 SOCS-3是胰島素、生長激素等多種激素的抑制因子，在中樞抑制其表達(dá)可能影響其他激素發(fā)揮其正常生理功能。因此，本研究首先通過建立高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖(diet-induced obesity，DIO)大鼠模型，檢測脂肪組織中SOCS-3 mRNA表達(dá)情況；然后，應(yīng)用慢病毒載體(lentivirus vector)介導(dǎo)的RNA干擾(RNAinter

3、ference，RNAi)技術(shù)在體外進行DIO大鼠脂肪細(xì)胞SOCS-3基因敲除，減少或阻斷肥胖大鼠脂肪細(xì)胞內(nèi)SOCS-3的表達(dá)，觀察其對脂肪細(xì)胞代謝的影響。 材料與方法： 一、飲食誘導(dǎo)肥胖大鼠模型的建立及指標(biāo)檢測 (一)建立飲食誘導(dǎo)肥胖大鼠模型 40只雄性Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1w后，按體重隨機分為2組：對照組7只喂飼普通基礎(chǔ)飼料，高脂組33只喂飼高脂飼料，高脂飼料含基礎(chǔ)飼料73％、豬油20％、酪蛋白

4、7％。第8w末，按體重增量大于對照組體重增量均值加上1倍標(biāo)準(zhǔn)差作為肥胖標(biāo)準(zhǔn)，從高脂組中篩選出10只大鼠作為肥胖組，5只處死用于血脂及附睪周圍脂肪組織SOCS-3 mRNA指標(biāo)檢測，5只用于大鼠原代脂肪基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)。實驗結(jié)束時，乙醚麻醉大鼠，腹主動脈采血，分離血清。 (二)血脂的測定 按試劑盒說明，用半自動生化分析儀測定血清中總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)含

5、量。 (三)脂肪組織SOCS-3 mRNA表達(dá)量測定 按TRIzol說明書操作步驟，提取100mg左右大鼠附睪周圍脂肪組織的總RNA。取總RNA量1μg，按Takara RNA PCR試劑盒說明，進行RT-PCR反應(yīng)。取2μl cDNA為模板，以β-actin作為內(nèi)參對照。各指標(biāo)反應(yīng)條件相同，RT-PCR反應(yīng)條件為：30℃10min，42℃30min，99℃5min，5℃5min。PCR反應(yīng)條件：94℃，2min預(yù)變性；

6、擴增的35個循環(huán)包括：變性94℃30s、退火56℃30s、延伸72℃1min。再72℃延伸10min。5μl目的基因產(chǎn)物，加預(yù)染液預(yù)染3min；2％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析儀拍照，以與內(nèi)參對照β-actin的比值作為目的基因表達(dá)的相對含量。 二、大鼠原代脂肪基質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)及成脂誘導(dǎo)分化 無菌條件下，取肥胖組大鼠附睪周圍脂肪組織，去除血管和其他組織，PBS反復(fù)清洗。加入午血清白蛋白和II型膠原酶混合物消化。過250μ

7、m篩網(wǎng)，50×g離心10min，200×g離心10min。加紅細(xì)胞裂解液，室溫靜置5～10min，過25μm篩網(wǎng)，200×g離心5min2次。加基礎(chǔ)培養(yǎng)基混懸后，接種到12孔板中。37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)。 當(dāng)原代培養(yǎng)的大鼠脂肪基質(zhì)細(xì)胞長成單層后，用PBS洗2次，更換為誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，3d后，更換去除異丁基.甲基黃嘌呤和羅格列酮的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，隔日換液。10d后，油紅O染色鑒定脂肪細(xì)胞及分化率。 三、SOCS-

8、3 shRNA慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建 慢病毒載體委托吉凱基因化學(xué)有限公司合成。 四、慢病毒感染及瘦素處理 肥胖組大鼠原代脂肪基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化10d后，感染慢病毒，共分3組，每組4個復(fù)孔，分別為空白對照組(CON組)，陰性對照病毒組(NC組)，SOCS-3shRNA慢病毒組(KD組)。96h后熒光鏡檢觀察感染率。感染5d后，每組取2孔加大鼠重組瘦素處理6h。 五、SOCS-3、ACC和ACO mRNA表達(dá)量測

9、定 TRIzol提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR法擴增目的基因，SOCS-3和GAPDH(內(nèi)參)的退火溫度為56℃；ACC和ACO的退火溫度為50℃，其它步驟同前。 六、統(tǒng)計分析 實驗結(jié)果用-x±s表示，用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗和單因素方差分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。 結(jié)果： 一、實驗期間大鼠體重變化 喂飼高脂飼料前，兩組大鼠體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但

10、1w后體重開始分化，此后，肥胖組大鼠體重一直高于對照組，至第8w末，肥胖組大鼠體重及體重增量與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 二、第8w末大鼠血脂水平及脂肪組織SOCS-3 mRNA表達(dá)情況 第8w末大鼠血清總膽固醇和甘油三酯水平，肥胖組顯著高于對照組(P<0.05)。而附睪周圍脂肪組織中SOCS-3 mRNA表達(dá)水平肥胖組也高于對照組，灰度值分析結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 三、大鼠

11、原代脂肪基質(zhì)細(xì)胞形態(tài)及成脂誘導(dǎo)分化 剛接種的大鼠原代脂肪基質(zhì)細(xì)胞呈圓形或類圓形。隨著培養(yǎng)時間的增加，細(xì)胞變得細(xì)長，呈典型的成纖維細(xì)胞形，生長比較旺盛。經(jīng)成脂誘導(dǎo)分化劑誘導(dǎo)48h后細(xì)胞變圓，體積增大，胞內(nèi)有脂滴形成。油紅O可將脂滴染成紅色，證明誘導(dǎo)所產(chǎn)生的細(xì)胞為脂肪細(xì)胞。計數(shù)分化率約為70％。 四、慢病毒感染分化后的大鼠脂肪基質(zhì)細(xì)胞 感染72h后熒光鏡檢觀察，CON組無熒光表達(dá)，NC組和KD組有綠色熒光表達(dá)，感染率

12、約80％。 五、感染慢病毒后大鼠脂肪細(xì)胞SOCS-3 mRNA表達(dá)水平 感染SOCS-3 shRNA慢病毒的大鼠脂肪細(xì)胞(KD組)SOCS-3 mRNA表達(dá)水平低于感染陰性對照慢病毒的大鼠脂肪細(xì)胞(NC組)(P<0.05)。SOCS-3基因有效敲減率約為54％。 六、各組細(xì)胞ACC和ACO mRNA表達(dá)水平 瘦素處理后，KD組大鼠脂肪細(xì)胞ACC mRNA表達(dá)水平低于NC組(P<0.05)；而ACO mRN