FMNL2誘導(dǎo)結(jié)直腸癌侵襲性偽足形成的分子機(jī)制.pdf

1、背景和目的：
　　 結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤，已經(jīng)成為我國(guó)三大癌癥之一，在西方發(fā)達(dá)國(guó)家，結(jié)直腸癌是僅次于肺癌的第二位惡性腫瘤。30～40％的結(jié)直腸癌患者行根治性手術(shù)治療和放化療等綜合性治療后發(fā)生肝肺轉(zhuǎn)移，一旦出現(xiàn)轉(zhuǎn)移很快威脅到患者的生命。因此，闡明結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，控制轉(zhuǎn)移是當(dāng)前研究的重要方向。
　　 目前認(rèn)為，轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞所經(jīng)歷的粘附特性的喪失、運(yùn)動(dòng)能力的增強(qiáng)、表達(dá)蛋白水解酶及新生血管形成等一系列改變，是侵襲和

2、轉(zhuǎn)移必不可少的過(guò)程。當(dāng)遇到各種細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)刺激時(shí)，腫瘤細(xì)胞隨時(shí)、精確地改變形狀和運(yùn)動(dòng)行為需要肌動(dòng)蛋白和微管蛋白的不斷重建，使細(xì)胞內(nèi)的微絲、葉狀偽足、層狀偽足、侵襲性偽足等不斷發(fā)生動(dòng)態(tài)改變，從而適應(yīng)侵襲和轉(zhuǎn)移等過(guò)程。偽足形成和細(xì)胞形態(tài)改變是侵襲轉(zhuǎn)移的起始步驟，細(xì)胞遷移頭部高度動(dòng)態(tài)性偽足結(jié)構(gòu)的形成依賴肌動(dòng)蛋白單體聚合和肌動(dòng)蛋白纖維的延長(zhǎng)。絲狀偽足和層狀偽足在腫瘤侵襲起始階段起粘附作用，侵襲性偽足與細(xì)胞外基質(zhì)降解密切相關(guān)。前期工作中，我們篩選

3、出在高轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的FMNL2基因，是重要的肌動(dòng)蛋白成核因子，并首次探討了FMNL2在結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制，結(jié)果顯示FMNL2在結(jié)直腸癌細(xì)胞株和組織中高表達(dá)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān);它能通過(guò)誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移;此外，HMGA1/miR-137/FMNL2軸參與結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　 文獻(xiàn)報(bào)道，F(xiàn)MNL2作為Cdc42的效應(yīng)蛋白促進(jìn)層狀偽足尖端的肌動(dòng)蛋白聚合和微絲的延長(zhǎng)促進(jìn)細(xì)胞的

4、運(yùn)動(dòng);FMNL2作為RhoC的效應(yīng)蛋白促進(jìn)癌細(xì)胞的圓形和阿米巴蟲(chóng)樣或間充質(zhì)樣侵襲遷移。由此可見(jiàn)，F(xiàn)MNL2能夠調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白相關(guān)的癌細(xì)胞侵襲和運(yùn)動(dòng)，然而其具體機(jī)制是什么？是否有相互作用蛋白參與其中？該作用受到哪些信號(hào)通路的調(diào)節(jié)？以上問(wèn)題尚不清楚，目前有關(guān)FMNL2相互作用蛋白的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 本研究將對(duì)FMNL2相互作用蛋白進(jìn)行篩選，從中選擇作用于結(jié)直腸癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲的候選蛋白，從侵襲性偽足的角度進(jìn)一步闡述其參與結(jié)直腸癌

5、侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。旨在揭示FMNL2參與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的新機(jī)制，為臨床干預(yù)腫瘤轉(zhuǎn)移提供新的潛在應(yīng)用靶點(diǎn)。
　　 方法：
　　 1.FMNL2相互作用蛋白的篩選和鑒定
　　 1)利用酵母雙雜交試驗(yàn)初步篩選FMNL2的相互作用蛋白，結(jié)合文獻(xiàn)選擇可能作用于癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲的一個(gè)基因作為研究靶點(diǎn);
　　 2)分別以FMNL2、SHANK2、cortactin抗體進(jìn)行免疫共沉淀;
　　 3)熒光共聚焦分別

6、觀察FMNL2和SHANK2，F(xiàn)MNL2和cortactin，F(xiàn)MNL2、SHANK2和cortactin的共定位;
　　 4)利用Western Blot和Q-PCR檢測(cè)30對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞株中相互作用蛋白FMNL2、SHANK2、cortactin的表達(dá);免疫組化檢測(cè)人結(jié)直腸癌組織中FMNL2、SHANK2、cortactin的表達(dá);并進(jìn)行相關(guān)性分析;
　　 2.FMNL2在侵襲性偽足形成中的作用
　　 1)

7、在4株人結(jié)直腸癌細(xì)胞中，利用免疫雙熒光標(biāo)記cortactin和F-actin觀察侵襲性偽足的形態(tài)和數(shù)目;
　　 2)利用免疫雙熒光標(biāo)記FMNL2與F-actin，觀察FMNL2與侵襲性偽足的共定位;
　　 3)以pEGFP-C1為骨架構(gòu)建actin表達(dá)載體;瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SW620細(xì)胞，利用活細(xì)胞成像技術(shù)觀察侵襲性偽足的動(dòng)態(tài)改變;
　　 4)利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體法將FMNL2-SiRNA（以NC-SiRNA為對(duì)照）瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

8、Lovo和SW620細(xì)胞，pCDNA3.0-FLAG-FMNL2-CT（以pCDNA3.0-FLAG為對(duì)照）瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HT29和SW480細(xì)胞48h后，行Western Blot和Q-PCR鑒定;
　　 5)在Lovo/SiFMNL2、SW620/SiFMNL2、SW480/FMNL2和HT29/FMNL2細(xì)胞中，進(jìn)行TRITC-鬼筆環(huán)肽和cortactin免疫熒光共定位觀察，比較轉(zhuǎn)染前后侵襲性偽足的形態(tài)和數(shù)量;
　　 6

9、)將Lovo/SiFMNL2、SW620/SiFMNL2、SW480/FMNL2和HT29/FMNL2細(xì)胞鋪入豬源性綠色熒光明膠制備的共聚焦小皿中進(jìn)行原位明膠降解實(shí)驗(yàn)，比較轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞基質(zhì)膠降解能力的差異;
　　 7)在Lovo/SiFMNL2和HT29/FMNL2細(xì)胞中，利用掃描電鏡觀察FMNL2對(duì)侵襲性偽足的形態(tài)及基質(zhì)膠降解的影響;
　　 8)在SW620/SiFMNL2和SW480/FMNL2細(xì)胞中，利用透射電鏡觀

10、察FMNL2對(duì)侵襲性偽足形態(tài)的影響;
　　 3.FMNL2/SHANK2在侵襲性偽足形成中的作用
　　 1)在Lovo/SiFMNL2、SW620/SiFMNL2、SW480/FMNL2和HT29/FMNL2細(xì)胞中，利用Western Blot檢測(cè)SHANK2、cortactin、p-(tyr466/421)cortactin的表達(dá)水平，利用Q-PCR檢測(cè)SHANK2、cortactin mRNA水平;
　　 2

11、)利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體法，分別將cortactin-SiRNA和SHANK2-SiRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入SW480/FMNL2以及HT29/FMNL2細(xì)胞中，行Western Blot和Q-PCR鑒定轉(zhuǎn)染效率;
　　 3)將cortactin-SiRNA和SHANK2-SiRNA分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SW480/FMNL2以及HT29/FMNL2細(xì)胞，利用Transwell小室檢測(cè)干擾前后癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化;
　　 4)將corta

12、ctin-SiRNA和SHANK2-SiRNA分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SW480/FMNL2以及HT29/FMNL2細(xì)胞，利用免疫熒光共定位和原位明膠降解實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)癌細(xì)胞侵襲性偽足數(shù)目和基質(zhì)降解能力的變化;
　　 4.FMNL2與SHANK2、cortactin相互結(jié)合結(jié)構(gòu)域的初步分析
　　 1)在SW480/FMNL2-CT-FLAG、SW480/FMNL2-NT-FLAG、SW480/ctrl細(xì)胞中，分別以cortactin抗體

13、和SHANK2抗體免疫共沉淀FLAG;
　　 2)以pGEX-6p-1為骨架構(gòu)建cortactin及截短子原核表達(dá)載體;以pCDNA3.0-FLAG為骨架構(gòu)建FMNL2(525-616A)和FMNL2(617-1092A)截短子真核表達(dá)載體;
　　 3)利用IPTG誘導(dǎo)pGEX-6p-1-cortactin及截?cái)嘧愚D(zhuǎn)化的BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)菌表達(dá) GST融合蛋白;利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體法將pCDNA3.0-FLAG-FM

14、NL2(525-616a)和FMNL2(617-1092a)分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入SW480細(xì)胞中表達(dá);利用GST-pull down實(shí)驗(yàn)沉淀FLAG;
　　 5.EGF/Cdc42調(diào)控FMNL2誘導(dǎo)的侵襲性偽足形成
　　 1)在SW620/SiFMNL2細(xì)胞中，給予hEGF刺激，利用Cdc42-pull down檢測(cè)Cdc42-GTP的表達(dá)水平;利用Western Blot檢測(cè)FMNL2、SHANK2、cortactin、p-

15、(tyr466/421)cortactin、Cdc42的表達(dá)水平;
　　 2)在HT29/FMNL2細(xì)胞中，給予酪氨酸受體激酶抑制劑AG1478處理，利用Cdc42-pull down檢測(cè)Cdc42-GTP的表達(dá)水平;利用Western Blot檢測(cè)FMNL2、SHANK2、cortactin、p-(tyr466/421)cortactin、Cdc42的表達(dá)水平;
　　 3)將Cdc42-SiRNA-1/-2/-3瞬時(shí)轉(zhuǎn)

16、染SW620細(xì)胞，行Western Blot和Q-PCR鑒定;
　　 4)在SW620/SiCdc42細(xì)胞中給予hEGF刺激，行Western Blot檢測(cè)Cdc42、FMNL2、SHANK2、cortactin的表達(dá)水平;
　　 5)將Cdc42-SiRNA和pRK5-Cdc42Q61L組成型活性質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染SW620細(xì)胞后，Western Blot檢測(cè)Cdc42、FMNL2、SHANK2、cortactin的表達(dá)水平;

17、
　　 6)在SW620/SiFMNL2和Lovo/SiFMNL2細(xì)胞中給予hEGF刺激，觀察癌細(xì)胞中侵襲性偽足數(shù)量和基質(zhì)膠降解能力的變化;
　　 7)將FMNL2-SiRNA和pRK5-Cdc42Q61L組成型活性質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至SW620和Lovo細(xì)胞，觀察癌細(xì)胞中侵襲性偽足的數(shù)量和基質(zhì)膠降解能力的變化。
　　 8)將FMNL2-SiRNA和pRK5-Cdc42Q61L組成型活性質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至SW620和Lovo細(xì)

18、胞，利用Transwell小室檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化;
　　 9)將HT29/FMNL2和SW480/FMNL2細(xì)胞給予酪氨酸激酶抑制劑AG1478抑制，觀察處理后細(xì)胞侵襲性偽足和基質(zhì)膠降解能力的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.FMNL2相互作用蛋白的篩選和鑒定
　　 1)利用酵母雙雜交試驗(yàn)，初步篩選7個(gè)FMNL2的相互作用蛋白包括COMMD10、EGFL6、ZNF38、ENO3、SHAN

19、K2、DNAJA1、RBM16，其中SHANK2(Cortactin-SH3 domain-binding protein;cortactin-binding protein1)是cortactin的結(jié)合蛋白，而cortactin是侵襲性偽足形成的關(guān)鍵蛋白，由此，我們選擇SHANK2作為進(jìn)一步研究的靶點(diǎn);
　　 2) FMNL2免疫共沉淀檢測(cè)到SHANK2和cortactin;SHANK2免疫共沉淀檢測(cè)到FMNL2和cortac

20、tin;cortactin免疫共沉淀檢測(cè)到SHANK2和FMNL2;以上說(shuō)明FMNL2、SHANK2和cortactin三者存在相互作用;
　　 3) FMNL2與SHANK2共定位于癌細(xì)胞胞膜和胞漿，F(xiàn)MNL2與cortactin共定位于胞膜和胞漿，F(xiàn)MNL2與SHANK2、cortactin三色共定位于胞膜和胞漿;
　　 4) SHANK2和cortactin在高轉(zhuǎn)移潛能的Lovo和SW620細(xì)胞中高表達(dá)，而在低轉(zhuǎn)移

21、潛能的SW480和HT29細(xì)胞中低表達(dá)，與FMNL2的表達(dá)趨勢(shì)一致。FMNL2與SHANK2的表達(dá)存在顯著正相關(guān)（r=0.898，P=0.000），F(xiàn)MNL2與cortactin的表達(dá)存在顯著正相關(guān)（r=0.872，P=0.000）;人結(jié)腸癌組織中癌中表達(dá)FMNL2、SHANK2和cortactin，三者的表達(dá)趨勢(shì)較一致。SHANK2和FMNL2存在顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.604，P=0.00)，cortactin與FMNL2也存在顯著

22、正相關(guān)關(guān)系(r=0.545，P=0.002)，SHANK2與cotactin也存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.602，P=0.00)。
　　 2.FMNL2在侵襲性偽足形成的作用
　　 1)獲得瞬時(shí)轉(zhuǎn)染FMNL2-SiRNA-1/-2/-3的SW620細(xì)胞，Q-PCR檢測(cè)干擾效率分別是0.65，0.57，0.61;獲得瞬時(shí)轉(zhuǎn)染FMNL2-SiRNA-1/-2/-3的Lovo細(xì)胞，Q-PCR檢測(cè)干擾效率分別是0.60，0.58，0

23、.63;獲得瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pCDNA3.0-FLAG-FMNL2-CT的HT29和SW480細(xì)胞，Q-PCR檢測(cè)過(guò)表達(dá)效率分別是111.268和126.630倍。Western Blot驗(yàn)證了FMNL2干擾后其表達(dá)明顯下調(diào)，F(xiàn)MNL2過(guò)表達(dá)后其表達(dá)明顯上調(diào);
　　 2)4株人結(jié)直腸癌細(xì)胞中均出現(xiàn)侵襲性偽足，紅色F-actin與綠色cortactin共定位于胞核周?chē)?。Lovo細(xì)胞侵襲性偽足表現(xiàn)為環(huán)狀和圓形粗大的顆粒以及少量散在點(diǎn)狀的顆粒

24、，大約18.2％的細(xì)胞出現(xiàn)侵襲性偽足;SW620細(xì)胞侵襲性偽足表現(xiàn)為梅花狀或者散在的點(diǎn)狀顆粒，大約79.35％的細(xì)胞出現(xiàn)侵襲性偽足;SW480細(xì)胞侵襲性偽足表現(xiàn)為梅花狀或者散在的點(diǎn)狀顆粒，較SW620細(xì)胞明顯小，大約17.26％的細(xì)胞出現(xiàn)侵襲性偽足;HT29細(xì)胞侵襲性偽足表現(xiàn)為散在細(xì)小的點(diǎn)狀顆粒，大約11.87％的細(xì)胞出現(xiàn)侵襲性偽足。與SW620細(xì)胞比較，Lovo，SW480和HT29細(xì)胞侵襲性偽足的含量較少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.0

25、00;P=0.000;P=0.000)，Lovo與SW480、HT29細(xì)胞比較，侵襲性偽足的含量沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.784，P=0.074)，SW480和HT29細(xì)胞比較，侵襲性偽足的含量沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.123);
　　 3)紅色F-actin與綠色FMNL2可共定位于胞膜和胞核周?chē)尸F(xiàn)黃色熒光，在胞核周?chē)鷪F(tuán)塊狀和顆粒狀黃色熒光是FMNL2與侵襲性偽足的共定位;
　　 4)獲得瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的SW620/acti

26、n細(xì)胞，自發(fā)綠色熒光;活細(xì)胞實(shí)時(shí)熒光成像觀察到SW620/actin細(xì)胞內(nèi)細(xì)顆粒狀和團(tuán)塊狀的侵襲性偽足，呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程;
　　 5)掃描電鏡可見(jiàn)HT29/control細(xì)胞腹側(cè)面侵襲性偽足細(xì)小數(shù)目少，基質(zhì)膠表面較平滑，細(xì)胞輕輕地停留其上，HT29/FMNL2細(xì)胞腹側(cè)面侵襲性偽足較粗較長(zhǎng)、數(shù)目較多，細(xì)胞下基質(zhì)膠受侵襲性偽足的粘附和降解作用出現(xiàn)明顯的破壞，細(xì)胞較牢固的扎根于基質(zhì)膠;Lovo/NC細(xì)胞腹側(cè)面侵襲性偽足粗長(zhǎng)，數(shù)量多，

27、細(xì)胞下基質(zhì)出現(xiàn)明顯的降解和破壞，Lovo/SiFMNL2細(xì)胞腹側(cè)面侵襲性偽足細(xì)小數(shù)目少，大部分基質(zhì)膠表面較平滑，細(xì)胞輕輕地停留其上;
　　 6)透射電鏡觀察到SW620細(xì)胞核的一側(cè)出現(xiàn)大量粗大的線粒體聚集，其間有一些圓形和不規(guī)則形的高密度勻質(zhì)的團(tuán)塊，沿著平行排列的微絲分布，即侵襲性偽足;當(dāng)SW620細(xì)胞FMNL2沉默后，細(xì)胞核周?chē)€粒體的聚集消失，在少量散在分布的線粒體之間，可見(jiàn)少量高密度勻質(zhì)的團(tuán)塊，微絲結(jié)構(gòu)消失，部分侵襲性偽足

28、形態(tài)模糊不清。在SW480細(xì)胞中未見(jiàn)明顯的線粒體聚集，其間可見(jiàn)少量圓形和不規(guī)則形的高密度勻質(zhì)的團(tuán)塊，當(dāng)SW480細(xì)胞過(guò)表達(dá)FMNL2后，在細(xì)胞核的一側(cè)出現(xiàn)明顯的線粒體聚集，其間出現(xiàn)多個(gè)粗大不規(guī)則形的高密度勻質(zhì)團(tuán)塊，還觀察到了層狀平行排列的高爾基體朝向侵襲性偽足;
　　 7)以SW620/NC細(xì)胞侵襲性偽足(86.52±2.61％)為對(duì)照，SW620/SiFMNL2細(xì)胞侵襲性偽足變小，含量顯著減少（29.64±3.01％，P=0.

29、000）以Lovo/SiNC細(xì)胞侵襲性偽足（20.09±2.64％）為對(duì)照，Lovo/SiFMNL2細(xì)胞侵襲性偽足變小，含量顯著減少（9.35±1.46％，P=0.000）;以HT29/ctrl細(xì)胞侵襲性偽足（11.90±2.13％）為對(duì)照，HT29/FMNL2細(xì)胞侵襲性偽足變大、含量顯著增多(30.67±3.50％，P=0.000)，以SW480/ctrl細(xì)胞細(xì)胞侵襲性偽足（19.64±1.62％）為對(duì)照，SW480/FMNL2細(xì)胞侵

30、襲性偽足變大、含量顯著增多(77.95±3.75％，P=0.000);
　　 8)以SW620/NC細(xì)胞明膠降解率(89.12±4.70％)為對(duì)照，SW620/SiFMNL2細(xì)胞明膠充分降解率顯著下降（31.90±3.23％，P=0.000）以Lovo/NC細(xì)胞明膠降解率（18.00±3.55％）為對(duì)照，Lovo/SiFMNL2細(xì)胞基質(zhì)膠充分降解率顯著下降（6.77±1.22％, P=0.007）;以HT29/ctrl細(xì)胞明膠降

31、解率(9.96±1.23％)為對(duì)照，HT29/FMNL2細(xì)胞明膠降解率顯著增高（31.20±3.63％, P=0.001），以SW480/ctrl細(xì)胞明膠降解率（15.47±1.93％）為對(duì)照，SW480/FMNL2細(xì)胞明膠降解率顯著增高(76.69±4.17％, P=0.000);
　　 3.FMNL2/SHANK2在侵襲性偽足形成中的作用
　　 1) Lovo/SiFMNL2和SW620/SiFMNL2細(xì)胞中SHAN

32、K2、cortactin、p-(tyr466/421)cortactin蛋白明顯表達(dá)下降，Lovo/SiFMNL2細(xì)胞中SHANK2、cortactin mRNA水平下降(0.68, P=0.000;0.55, P=0.001);SW620/SiFMNL2細(xì)胞中SHANK2、cortactin mRNA水平下降(0.76, P=0.000;0.68, P=0.001);SW480/FMNL2和 HT29/FMNL2細(xì)胞中 SHANK2、

33、cortactin、p-(tyr466/421)cortactin蛋白水平明顯上升，SW480/FMNL2細(xì)胞中SHANK2、cortactin mRNA水平升高(4.17, P=0.003;9.60, P=0.000), HT29/FMNL2細(xì)胞中SHANK2、cortactin mRNA水平升高4.50倍(4.50，P=0.000;7.32, P=0.000)
　　 2)在SW480/FMNL2細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SHANK2-S

34、iRNA-1/-2/-3，干擾效率分別是0.88、0.72、0.86,在SW480/FMNL2細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染cortactin-SiRNA-1/-2/-3，干擾效率分別是0.36、0.56、0.58;HT29/FMNL2細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SHANK2-SiRNA-1/-2/-3，干擾效率分別是0.81、0.66、0.87,在HT29/FMNL2細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染cortactin-SiRNA-1/-2/-3，干擾效率分別是0.47、0.75、0

35、.78;Western Blot檢測(cè)到SW480/FMNL2/SiSHANK2和HT29/FMNL2/SiSHANK2細(xì)胞中SHANK2蛋白水平明顯下降，cortactin蛋白水平不改變;SW480/FMNL2/SiSHANK2和HT29/FMNL2/Sicortactin細(xì)胞中cortactin蛋白水平明顯下降， SHANK2蛋白水平不改變;
　　 3)遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:以SW480/FMNL2/NC遷移率(319.8±

36、28.4)為對(duì)照，SW480/FMNL2/SiCortactin和SW480/FMNL2/SiSHANK2細(xì)胞的遷移能力均顯著下降（78.4±12.5,P=0.000;108.8±11.8,P=0.000）;以SW480/FMNL2/NC侵襲率（284.4±28.3）為對(duì)照，SW480/FMNL2/SiCortactin和SW480/FMNL2/SiSHANK2細(xì)胞的侵襲能力也顯著下降（60.8±9.1，P=0.000;91.0±13.

37、4， P=0.000）;以HT29/FMNL2/NC遷移率（18.8±3.8）為對(duì)照，HT29/FMNL2/SiCortactin和HT29/FMNL2/SiSHANK2細(xì)胞的遷移能力顯著下降（1.6±0.9，P=0.000;3.0±0.7，P=0.000）;以HT29/FMNL2/NC侵襲率（14.4±3.8）為對(duì)照，HT29/FMNL2/SiCortactin和HT29/FMNL2/SiSHANK2細(xì)胞的侵襲能力也顯著下降（1.8±

38、0.8，P=0.004;4.0±1.0，P=0.007）;以HT29/FMNL2/NC侵襲性偽足（30.31±3.81％）為對(duì)照，HT29/FMNL2/SiSHANK2細(xì)胞侵襲性偽足變小，數(shù)目不顯著變化（26.00±2.25％，P=0.026）;HT29/FMNL2/Sicortactin細(xì)胞侵襲性偽足變小，數(shù)目顯著減少（8.13±1.40％，P=0.000）;以SW480/FMNL2/NC侵襲性偽足(78.52±4.06％)為對(duì)照，S

39、W480/FMNL2/SiSHANK2細(xì)胞侵襲性偽足變小，數(shù)目顯著減少（60.72±3.03％，P=0.000）;SW480/FMNL2/Sicortactin細(xì)胞侵襲性偽足變小，數(shù)目顯著減少（18.42±2.17％，P=0.000）;
　　 4)以HT29/FMNL2/NC明膠降解率（30.07±3.02％）為對(duì)照，HT29/FMNL2/SiSHANK2細(xì)胞明膠降解率顯著下降（24.43±2.33％，P=0.026），HT29

40、/FMNL2/Sicortactin細(xì)胞明膠降解率顯著下降（7.97±1.37％，P=0.000）;以SW480/FMNL2/NC明膠降解率（81.17±2.37％）為對(duì)照，SW480/FMNL2/SiSHANK2細(xì)胞明膠降解率顯著下降（61.60±3.85％，P=0.000），SW480/FMNL2/Sicortactin細(xì)胞明膠降解率顯著下降(19.36±2.06％，P=0.000);
　　 4.FMNL2與SHANK2、c

41、ortactin相互結(jié)合結(jié)構(gòu)域的初步分析
　　 1) SHANK2免疫共沉淀結(jié)果顯示，在SW480/FMNL2-CT細(xì)胞中檢測(cè)到FLAG，在SW480/FMNL2-NT細(xì)胞以及SW480/ctrl細(xì)胞中未檢測(cè)到FLAG，說(shuō)明SHANK2與FMNL2-CT存在相互作用，與FMNL2-NT不存在相互作用;
　　 2) cortactin免疫共沉淀結(jié)果顯示，在SW480/FMNL2-CT細(xì)胞中檢測(cè)到FLAG，在SW480/FM

42、NL2-NT細(xì)胞以及SW480/ctrl細(xì)胞中未檢測(cè)到FLAG，說(shuō)明cortactin與FMNL2-CT存在相互作用，與FMNL2-NT不存在相互作用;
　　 3)成功構(gòu)建了cortactin及截短子原核表達(dá)載體:pGEX-6p-1-cortactin(1-550a)、pGEX-6p-1-cortactin(1-325a)、pGEX-6p-1-cortactin(83-495a)、pGEX-6p-1-cortactin(326-

43、550a)、pGEX-6p-1-cortactin(496-550a)和FMNL2截短子真核表達(dá)載體:pCDNA3.0-FLAG-FMNL2(525-616a)、FMNL2(617-1092a);
　　 4)成功表達(dá)了GST融合蛋白:GST-cortactin(1-550a)、GST-cortactin(1-325a)、GST-cortactin(83-495a)、GST-cortactin(326-550a)和GST-cort

44、actin(496-550a);成功表達(dá)FLAG融合蛋白:FLAG-FMNL2(525-616a)、FLAG-FMNL2(617-1092a);
　　 5) GST-pull down結(jié)果顯示，在SW480/FMNL2-CT細(xì)胞和SW480/FMNL2(525-616a)細(xì)胞中檢測(cè)到 FLAG，在 SW480/FMNL2-NT、SW480/FMNL2(617-1092a)和SW480細(xì)胞/ctrl未檢測(cè)到FLAG，說(shuō)明corta

45、ctin(496-550a)即cortactin-SH3直接結(jié)合FMNL2(525-616a)。
　　 5.EGF/Cdc42調(diào)控FMNL2誘導(dǎo)的侵襲性偽足形成
　　 1)將SW620/SiFMNL2以及SW620/NC細(xì)胞給予hEGF刺激，細(xì)胞中FMNL2、SHANK2、cortactin、p-(tyr466/421)cortactin、Cdc42、Cdc42-GTP的表達(dá)水平明顯升高;
　　 2)將HT29/

46、FMNL2以及HT29/ctrl細(xì)胞給予酪氨酸激酶抑制劑AG1478處理，細(xì)胞中FMNL2、SHANK2、cortactin、p-(tyr466/421)cortactin、Cdc42、Cdc42-GTP的表達(dá)水平明顯減少;
　　 3) Q-PCR檢測(cè)SW620細(xì)胞Cdc42-SiRNA-1,2,3瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后沉默效率分別是0.83、0.74、0.87, Western Blot驗(yàn)證了該蛋白表達(dá)下調(diào);
　　 4) West

47、ern Blot檢測(cè)到SW620/SiCdc42細(xì)胞中Cdc42、FMNL2、SHANK2、cortactin蛋白表達(dá)水平下調(diào)，SW620/SiCdc42/Cdc42Q61L細(xì)胞中Cdc42、FMNL2、SHANK2、cortactin蛋白表達(dá)水平較SW620/SiCdc42細(xì)胞組明顯升高;
　　 5)在SW620/SiCdc42細(xì)胞中給予hEGF刺激，Western Blot檢測(cè)到細(xì)胞中Cdc42、FMNL2、SHANK2、c

48、ortactin蛋白表達(dá)水平明顯升高;
　　 6)以SW620/SiFMNL2細(xì)胞侵襲性偽足（36.06±5.69％）為對(duì)照，SW620/SiFMNL2細(xì)胞給予hEGF刺激后侵襲性偽足顯著增多（82.95±5.53％，P=0.000）增大;SW620/SiFMNL2/Cdc42Q61L細(xì)胞中侵襲性偽足顯著增多(75.48±5.06％，P=0.000)增大;以Lovo/SiFMNL2細(xì)胞侵襲性偽足(9.37±1.67％)為對(duì)照，L

49、ovo/SiFMNL2細(xì)胞給予hEGF刺激后侵襲性偽足顯著增多（19A2±2.83％，P=0.001）增大;Lovo/SiFMNL2/Cdc42Q61L細(xì)胞中侵襲性偽足顯著增多（19.17±1.90％，P=0.000）增大;
　　 7)以SW620/SiFMNL2細(xì)胞明膠降解率（36.93±4.40％）對(duì)照，SW620/SiFMNL2細(xì)胞給予hEGF刺激后，明膠降解率顯著升高(92.24±2.43％，P=0.000);SW620

50、/SiFMNL2/Cdc42Q61L細(xì)胞明膠降解率顯著升高
　　 （88.36±2.72％，P=0.000）;以Lovo/SiFMNL2細(xì)胞明膠降解率（9.14±1.94％）為對(duì)照，Lovo/SiFMNL2細(xì)胞給予hEGF刺激后明膠降解率顯著增多（20.25±2.86％，P=0.001）;Lovo/SiFMNL2/Cdc42Q61L細(xì)胞明膠降解率顯著增多（19.81±1.68％，P=0.001）;
　　 8) Trans

51、well小室檢測(cè)結(jié)果顯示:以SW620/SiFMNL2細(xì)胞遷移率(193.0±15.6)為對(duì)照，給予hEGF刺激后細(xì)胞遷移率顯著升高(304.8±14.3，P=0.000)，SW620/SiFMNL2/Cdc42Q61L細(xì)胞遷移率顯著升高（276.2±14.2，P=0.000）。以SW620/SiFMNL2細(xì)胞侵襲率（109.0±11.47）為對(duì)照，給予hEGF刺激后細(xì)胞侵襲率顯著升高（243.0±13.9， P=0.000），SW62

52、0/SiFMNL2/Cdc42Q61L細(xì)胞侵襲率顯著升高（207.0±18.23，P=0.000）。以Lovo/SiFMNL2細(xì)胞遷移率（156.2±14.9）為對(duì)照，給予hEGF刺激后細(xì)胞遷移率顯著升高（295.8±17.0，P=0.000），Lovo/SiFMNL2/Cdc42Q61L細(xì)胞遷移率顯著升高（277±17.2，P=0.000）以Lovo/SiFMNL2細(xì)胞侵襲率（77.6±8.3）為對(duì)照，給予hEGF刺激后細(xì)胞侵襲率顯著

53、升高（217.8±18.1，P=0.000），Lovo/SiFMNL2/Cdc42Q61L細(xì)胞侵襲率顯著升高（197.4±15.0，P=0.000）;
　　 9)以HT29/FMNL2細(xì)胞侵襲性偽足（30.00±3.44％）為對(duì)照，給與AG1478抑制后細(xì)胞侵襲性偽足顯著減少（11.89±1.89％，P=0.000）變小，以SW480/FMNL2細(xì)胞侵襲性偽足（80.76±3.44％）為對(duì)照，給與AG1478抑制后細(xì)胞侵襲性偽足

54、顯著減少（18.89±2.57％，P=0.000）變小;
　　 10)以HT29/FMNL2細(xì)胞明膠降解率（35.19±6.00％）對(duì)照，給予AG1478抑制后細(xì)胞明膠降解率顯著下降（10.11±2.06％，P=0.002），以SW480/FMNL2細(xì)胞明膠降解率（81.69±4.12％）對(duì)照，給予AG1478抑制后細(xì)胞明膠降解率顯著下降（16.69±2.86％，P=0.000）。
　　 結(jié)論：
　　 1.FMN

55、L2不僅通過(guò)支架蛋白SHANK2與cortactin作用，還直接與cortactin相互作用;
　　 2.FMNL2-CT段與SHANK2直接結(jié)合，F(xiàn)MNL2-FH1與cortactin-SH3直接結(jié)合;
　　 3.FMNL2促進(jìn)人結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲性偽足的形成;
　　 4.SHANK2和cortactin是FMNL2誘導(dǎo)侵襲性偽足形成所必需的;
　　 5.hEGF/Cdc42信號(hào)通路在上游調(diào)控FMNL2誘