人參總皂苷對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化的影響.pdf

1、 目的：通過鏈脲佐菌素(STZ)作用于大鼠胰島細(xì)胞株(INS-1)建立體外大鼠INS-1胰島細(xì)胞損傷模型后,應(yīng)用Transwell共培養(yǎng)體系與大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSC)間接共培養(yǎng),同時(shí)加入不同濃度的人參總皂苷(TSPG)干預(yù),觀察人參總皂苷對BM-MSC向胰島樣細(xì)胞分化的影響,并初步探討其機(jī)制。方法：體外分別培養(yǎng)INS-1細(xì)胞和BM-MSC,取生長狀態(tài)良好的INS-1接種于Transwell培養(yǎng)板下層,生長達(dá) 80-90﹪融

2、合后,用無血清培養(yǎng)基同步化 24h,再予不同濃度的 STZ干預(yù) 24h,通過觀察細(xì)胞形態(tài)及丙二醛(MDA)的測定,選擇合適的濃度來建立胰島細(xì)胞損傷模型,隨即分為5個(gè)組：(A)單純 BM-MSC 培養(yǎng)組；(B)BM-MSC+INS-1 共培養(yǎng)組；(C)BM-MSC+INS-1+低濃度人參皂苷組；(D)BM-MSC+INS-1+中濃度人參皂苷組；(E)BM-MSC+INS-1+高濃度人參皂苷組。各組培養(yǎng)液相同,均為含胎牛血清的50﹪1640

3、培養(yǎng)基+50﹪DMEM-L培養(yǎng)基,其中B、C、D、E組的BM-MSC均接種于Transwell板上層。共培養(yǎng)9天后用雙硫腙染色初步鑒定誘導(dǎo)后細(xì)胞,并提取誘導(dǎo)后細(xì)胞總蛋白及總RNA,用Western-Blot檢測各組細(xì)胞內(nèi)PDX-1蛋白含量,用RT-PCR檢測特異性胰島素基因的表達(dá)水平。結(jié)果：(1)胰島細(xì)胞損傷模型的建立：不同濃度的STZ干預(yù)細(xì)胞24h后,細(xì)胞丙二醛(MDA)含量逐漸增加,并且在 0.8mg/ml 的濃度時(shí)增加更為顯著,呈

4、現(xiàn)出了明顯的細(xì)胞損傷效應(yīng)。(2)雙硫腙染色鑒定誘導(dǎo)后細(xì)胞：單純 BM-MSC培養(yǎng)組不能被染色,其余各組均不同程度地被染為棕黃色,表明誘導(dǎo)后細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中富含鋅離子,證實(shí)有胰島素分泌細(xì)胞的存在。(3)實(shí)驗(yàn)各組PDX-1蛋白表達(dá)水平的變化：單純BM-MSC培養(yǎng)組無PDX-1蛋白的表達(dá),其余各組誘導(dǎo)后細(xì)胞均有表達(dá),而其中人參皂苷組較無人參皂苷組表達(dá)水平有不同程度的升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且隨著人參皂苷濃度的升高,PDX-1

5、蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)增高趨勢。(4)實(shí)驗(yàn)各組胰島素基因表達(dá)的變化：單純BM-MSC培養(yǎng)組無胰島素基因無表達(dá),其余各組誘導(dǎo)后細(xì)胞均有表達(dá),其中人參皂苷組較無人參皂苷組表達(dá)水平有不同程度的升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且呈現(xiàn)濃度依耐性。(5)葡萄糖刺激實(shí)驗(yàn)：將誘導(dǎo)后細(xì)胞分別在含5.6 mmol/L 和 16.7 mmol/L 葡萄糖的培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)2 h,采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定上清中的胰島素水平。單純BM-MSC 培養(yǎng)

6、組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中無胰島素釋放,而共培養(yǎng)組誘導(dǎo)后細(xì)胞在16.7 mmol/L 高糖濃度刺激后胰島素釋放水平較5.6 mmol/L基礎(chǔ)糖濃度明顯增加(P < 0.05)。結(jié)論：(1)0.8mg/ml的STZ處理INS-1細(xì)胞24h,可以對體外培養(yǎng)的INS-1細(xì)胞造成胰島細(xì)胞損傷模型。(2)BM-MSC與INS-1細(xì)胞在體外間接共培養(yǎng)的條件下,BM-MSC可以被誘導(dǎo)為胰島樣細(xì)胞,并且在高糖刺激下可以分泌胰島素。(3)人參總皂苷在骨髓間充質(zhì)干