縊蟶肝胰臟cDNA文庫構建和免疫相關基因的克隆與表達研究.pdf

1、縊蟶(Sinonovacula constricta Lamarck)是我國重要的灘涂經(jīng)濟貝類，與牡蠣、蛤仔、泥蚶一起號稱我國“四大養(yǎng)殖貝類”。但是近年來，縊蟶病害經(jīng)常出現(xiàn)，大批死亡現(xiàn)象時有發(fā)生，提高縊蟶抗病能力是減少縊蟶病害發(fā)生的重要途徑。本研究構建和分析了縊蟶肝胰臟cDNA文庫，篩選了免疫相關基因，應用RACE技術以及長PCR技術獲得了免疫相關基因cDNA和DNA全長，利用實時熒光定量PCR技術分析了基因的組織表達以及細菌誘導后的時

2、間表達，以期獲得縊蟶的免疫候選基因，為縊蟶抗病新藥開發(fā)、抗病新品種選育等工作奠定基礎。
　　1.采用DNS酶均一化處理技術，構建縊蟶肝胰臟cDNA文庫，共獲得5296個ESTs序列，經(jīng)拼接后獲得了4013個單一基因(Unigene)，其中包括540個重疊群(Contig)和3473個單一序列（Singleton）。通過BLAST分析，79.3％序列為未知基因，20.7％序列為已知功能基因，其中43條序列是免疫相關基因。根據(jù)其功能，

3、這些免疫相關基因可被分為5類，即20個蛋白酶和蛋白酶調(diào)節(jié)子基因、6個粘著蛋白基因、3個壓力蛋白基因、3個抗菌肽基因、6個溶酶體酶基因和5個信號轉導基因。
　　2.從文庫中篩選出2條β-actin同源序列，分別命名為β-ACTIN1和β-ACTIN2，cDNA全長分別為1552 bp和1454 bp，均含有1131bp的開放閱讀框，同時通過同源克隆技術獲得縊蟶18S rRNA基因。比較分析了18S rRNA，β-ACTIN1和β-A

4、CTIN2基因的組織表達（水管、鰓、斧足、外套膜、肝胰臟和性腺）穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)18S rRNA基因最穩(wěn)定，適合作為內(nèi)參基因。以18S rRNA基因為內(nèi)參基因，組織表達及鰻弧菌誘導后的時間表達分析結果顯示，2個β-actin基因的表達出現(xiàn)了顯著變化，表明2個β-actin基因不適合作為內(nèi)參基因。
　　3.從文庫中獲得2條與C型凝集素同源序列，cDNA全長分別為644 bp和1659bp，分別命名為ScCTL-1和ScCTL-2。ScC

5、TL-1為標準長型C型凝集素，ScCTL-2為緊湊型C型凝集素，二者均具有1個糖識別結構域(CRD)。熒光定量PCR檢測結果顯示，經(jīng)鰻弧菌和副溶血弧菌誘導后，縊蟶ScCTL-1和ScCTL-2 mRNA在不同組織中的時間表達譜變化趨勢不同，表明2個C型凝集素具有不同的功能。
　　4.從文庫中篩選出一條與半乳糖凝集素(Galectins)同源序列，cDNA全長為1278 bp，具有識別半乳糖凝集素的特異性序列(H-NRP，WG-EE

6、)，命名為Sc-Galectin。預測蛋白包含2個串聯(lián)的CRDs蛋白結構域，是一個串聯(lián)重復型半乳糖凝集素。組織表達結果表明，Sc-Galectin mRNA在肝胰臟的表達量顯著高于其他組織。經(jīng)鰻弧菌處理8h和48h后，在6個組織中，縊蟶Sc-Galectin mRNA的表達均顯著上調(diào)，經(jīng)副溶血弧菌和鰻弧菌分別處理72 h和20 h后，在6個組織中，縊蟶Sc-Galectin mRNA的表達均顯著下調(diào)并達到最大值。
　　5.從文庫中

7、篩選出一條補體(Clq)同源序列，cDNA全長為712 bp，命名為ScClq。預測蛋白包含一個18個氨基酸的信號肽和一個136個氨基酸的Clq結構域。組織表達結果表明，ScClq mRNA在肝胰臟的表達量顯著高于其他組織。經(jīng)鰻弧菌和副溶血弧菌誘導后，縊蟶ScClq mRNA在6個組織中的表達水平均出現(xiàn)顯著上調(diào)和下調(diào)，其中在水管、鰓、斧足、外套膜和性腺中的表達變化的趨勢比較明顯。
　　6.從文庫中篩選出一條鐵蛋白(ferritin

8、)同源序列，cDNA全長為1106 bp，命名為ScFERs。預測蛋白包含一個高度保守的鐵氧化活性中心結構域，該結構域由7個與脊椎動物H型鐵蛋白完全一致的氨基酸殘基組成，但是在5'非編碼區(qū)缺失鐵調(diào)節(jié)區(qū)域(IRE)。組織表達結果表明，ScFERs mRNA在肝胰臟的表達量顯著高于其他組織。經(jīng)鰻弧菌和副溶血弧菌誘導后，ScFERs mRNA在6個組織中的表達水平均出現(xiàn)顯著上調(diào)和下調(diào)，其中在外套膜、斧足和性腺中的表達變化的趨勢比較明顯。

9、>　　7.從文庫中篩選出一條熱休克蛋白70(HSP70)同源序列，cDNA全長為2335bp，是細胞質(zhì)中的結構型HSC70亞家族基因成員，被命名為Sc-Hsc70。組織表達分析結果顯示，ScHsc70 mRNA在外套膜中的表達量最低，而在水管中的表達量最高。經(jīng)鰻弧菌和副溶血弧菌誘導后，ScHsc70 mRNA在縊蟶肝胰臟組織的表達水平呈上調(diào)趨勢，且分別在20 h和30 h后達到最大。結果表明縊蟶ScHsc70基因可能在介導細菌誘導引起的

10、免疫應答中起到重要作用。
　　8.從文庫中篩選出一條小熱休克蛋白(sHSP)同源序列，cDNA全長為1220bp，該基因的氨基酸序列具有典型的小熱休克蛋白家族的特征結構:a-晶體蛋白(a-crystallin)結構域，被命名為Sc-sHSP。組織表達結果表明，Sc-sHSP mRNA在肝胰臟的表達量顯著高于其他組織。經(jīng)鰻弧菌和副溶血弧菌誘導后，Sc-sHSPmRNA在肝胰臟組織的表達水平呈上調(diào)趨勢，且均在20 h后達到最大，結果表