真核表達(dá)載體過表達(dá)JMJD3基因?qū)毙园籽L-60細(xì)胞株影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：急性白血病的發(fā)生、發(fā)展、治療療效及預(yù)后與異常的表觀遺傳學(xué)有關(guān)。其中，組蛋白甲基化修飾是表觀遺傳修飾的重要類型之一，JMJD3是組蛋白H3賴氨酸27三甲基化(H3K27me3)去甲基化酶，多種腫瘤JMJD3突變或表達(dá)下降，同時(shí)多種基因啟動(dòng)子區(qū)H3K27me3含量增多。本課題以去甲基化酶JMJD3為研究對(duì)象，檢測(cè)急性白血病細(xì)胞組蛋白H3K27位點(diǎn)甲基化狀態(tài)及JMJD3表達(dá)情況，干預(yù)DNA甲基化和組蛋白甲基化模式的平衡，探討去甲基化酶J

2、MJD3對(duì)急性白血病HL-60細(xì)胞生物學(xué)活性的影響，揭示急性白血病的表觀遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)制，挖掘新的靶分子，為白血病診斷和基因靶向治療提供新的思路。
　　方法：（1）Western blot檢測(cè)三種急性髓性白血病細(xì)胞HL-60、U937、NB4株中H3K27me3甲基化及去甲基化酶JMJD3的表達(dá)情況。（2）合成JMJD3寡核苷酸序列，將其連入Pegfp-C3質(zhì)粒中，構(gòu)建Pegfp-C3-JMJD3真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞，PC

3、R、WESTERN BLOT檢測(cè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HL-60后JMD3及H3K27甲基化水平變化。（3）應(yīng)用四唑鹽（MTT）法繪制細(xì)胞生長曲線，觀察Pegfp-C3-JMJD3對(duì)HL-60細(xì)胞增殖的影響；流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡；Western blot檢測(cè)Pegfp-C3-JMJD3轉(zhuǎn)染HL60細(xì)胞后H3K27甲基化水平及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白p15、p16表達(dá)水平的變化。
　　結(jié)果：（1）在HL-60、U937、NB

4、4三種急性白血病細(xì)胞組蛋白H3K27me3均高表達(dá)，同時(shí)去甲基化酶JMJD3表達(dá)減少。（2）Pegfp-C3-JMJD3轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，轉(zhuǎn)染效率達(dá)75％±2.34%，與未轉(zhuǎn)染組比較，轉(zhuǎn)染組的JMJD3 mRNA表達(dá)增加74.29%，H3K27me3蛋白表達(dá)量降低了78.54%。（3）Pegfp-C3-JMJD3轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖率顯著降低，48、72、96、120小時(shí)細(xì)胞的增殖率分別為（68.54±0.73）%，（49.10±2.31）%

5、，（41.22±1.01）%，（40.68±2.45）%，明顯低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組（p<0.05）。Pegfp-C3-JMJD3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組G2/M比例明顯增加，達(dá)到（46.02±0.92）%，高于空白對(duì)照組（18.56±3.71）%和陰性質(zhì)粒對(duì)照組（22.86±1.45）%，p<0.05。空白對(duì)照組、陰性質(zhì)粒對(duì)照組、轉(zhuǎn)染組S期細(xì)胞分別為（33.54±1.41）%、（33.24±1.05）%、（10.94±1.78）%，轉(zhuǎn)染組明顯低

6、于其他兩個(gè)對(duì)照組（p<0.05）。比較陰性質(zhì)粒對(duì)照組和空白組，轉(zhuǎn)染組抑癌基因蛋白p15表達(dá)上調(diào)2.13倍、p16表達(dá)上調(diào)2.07倍。Pegfp-C3-JMJD3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的48小時(shí)凋亡率分別為（56.1±1.08）%，而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組的凋亡率分別為（1.15±0.25）%和（1.96±0.63）%（p<0.05）。
　　結(jié)論：（1）HL-60、U937、NB4三種急性白血病細(xì)胞組蛋白H3K27me3均高表達(dá)，同時(shí)去甲基化酶