骨橋蛋白影響卵巢癌細(xì)胞SKOV3侵襲轉(zhuǎn)移潛能的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的: 檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞株SKOV3中骨橋蛋白（osteopontin，OPN）和其他轉(zhuǎn)移相關(guān)基因尿激酶型纖溶酶原激活劑（urokinase plasminogen activator，uPA）和乙酰肝素酶（heparanase，HPA）的表達(dá)，研究OPN對(duì)卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能的影響并初步探討其可能機(jī)制。 材料與方法: 卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞株SKOV3細(xì)胞復(fù)蘇后常規(guī)培養(yǎng)于含有10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，

2、用0.25％的胰酶消化傳代。用脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1（-）/OPN，同時(shí)轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1（-）作為對(duì)照，并利用G418篩選獲穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)RT-PCR檢測(cè)OPN mRNA表達(dá)水平，Touching凝膠成像系統(tǒng)分析條帶灰度值，并與β-actin相比較計(jì)算結(jié)果以分析OPN表達(dá)強(qiáng)度。用Western-blot檢測(cè)OPN蛋白表達(dá)，用DAB顯色盒顯示蛋白條帶。采用T

3、ouching凝膠成像系統(tǒng)軟件測(cè)定Western-blot條帶凈灰度值，并與內(nèi)參結(jié)果比較，計(jì)算其比值。以無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，在4℃、12000r/min的條件下，離心5min，分取各組細(xì)胞上清液用ELISA測(cè)定OPN、uPA及HPA的表達(dá)，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值）。并采用基質(zhì)凝膠侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組細(xì)胞侵襲力，甲醇固定，伊紅染色，以侵襲細(xì)胞的相對(duì)數(shù)目來(lái)表示腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果率的比較采用x2檢驗(yàn)，兩樣本間均數(shù)

4、比較行t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果: 1、RT-PCR結(jié)果示重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組OPN的相對(duì)表達(dá)量（1.268±0.046）明顯高于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（0.550±0.027），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。Western-blot檢測(cè)OPN蛋白表達(dá)，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組OPN的蛋白表達(dá)（0.642±0.079）較空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組高（0.371±0.033），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。 2、ELISA法

5、檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組OPN為（3.605±0.205）ng/ml，空白質(zhì)粒對(duì)照組為（1.602±0.119）ng/ml，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組uPA為（5.342±0.031）ng/ml，空白質(zhì)粒對(duì)照組為（1.956±0.047）ng/ml，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組HPA為（2.762±0.145）ng/ml，空白質(zhì)粒對(duì)照組為（2.692±0.140）ng/ml，兩

6、組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 3、基質(zhì)凝膠侵襲實(shí)驗(yàn)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞透膜細(xì)胞數(shù)為（36.459±4.447），空白質(zhì)粒對(duì)照組細(xì)胞透膜細(xì)胞數(shù)為（18.128±6.017），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論: 1、OPN對(duì)卵巢癌細(xì)胞的侵襲潛能有促進(jìn)作用。 2、OPN可能通過(guò)上調(diào)uPA的表達(dá)以促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。 3、可為進(jìn)一步探尋以O(shè)PN為靶點(diǎn)的卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移的治療和進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)