中國漢族人群血脂水平及冠心病的遺傳易感性研究.pdf

1、冠心病是世界上最常見的、致死率最高的慢性疾病之一。隨著我國社會經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展、生活方式的改變以及人口老齡化，冠心病的發(fā)病率呈逐年增長的趨勢。世界衛(wèi)生組織預(yù)測我國每年有超過100萬人死于冠心病。冠心病將嚴(yán)重威脅人民生命和健康，并為社會和家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。為此，加強(qiáng)開展以冠心病為代表的心血管疾病的基礎(chǔ)研究和人群防治工作，既是我國21世紀(jì)社會發(fā)展所面臨的重大公共衛(wèi)生問題，又是保障我國經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展、構(gòu)建和諧社會的重大需求。冠心病的發(fā)生是

2、多因素參與的復(fù)雜過程，更是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果。眾所周知，冠心病的發(fā)病與吸煙、肥胖、高血壓、糖尿病、血脂異常等有關(guān)。但是，這些傳統(tǒng)的危險因素僅能解釋50％-60％冠心病的發(fā)病原因，另外有40％-50％的發(fā)病歸因于遺傳因素。冠心病家族史是影響冠心病發(fā)病風(fēng)險的一個重要的獨(dú)立危險因素。在對冠心病的病因?qū)W研究中，脂質(zhì)浸潤學(xué)說是最早被提出和證實(shí)的。冠心病的發(fā)生和發(fā)展是動脈粥樣硬化的過程：由于血漿脂質(zhì)水平較高，血漿脂質(zhì)進(jìn)入動脈內(nèi)膜并沉積

3、在內(nèi)膜下，引起血管內(nèi)膜的炎性免疫反應(yīng)和血小板聚集，導(dǎo)致血栓和斑塊形成，最終影響到心肌供血不足甚至缺血壞死。已經(jīng)有大量研究證實(shí)血脂水平的改變與冠心病的發(fā)病有密切關(guān)系。高膽固醇血癥等家系研究也證實(shí)了血脂水平受到遺傳因素的影響。所以，在過去30年中對冠心病的遺傳易感性研究主要以是血脂代謝相關(guān)基因作為候選基因來進(jìn)行的。隨著國際人類基因組測序計劃的完成和單核苷酸多態(tài)性單體型圖譜的構(gòu)建完成，在全基因組范圍內(nèi)高效快速的篩選并定位復(fù)雜疾病或性狀的遺傳易

4、感性位點(diǎn)成為當(dāng)今世界的一個研究熱點(diǎn)。自2007年以來，歐美國家在幾十種常見復(fù)雜疾?。ò┌Y、冠心病、糖尿病等）中開展了大規(guī)模的全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association studies，GWAS）。據(jù)統(tǒng)計，近五年全世界共開展了大約600個GWAS，大約在150種不同的疾病或性狀中找到了800個陽性遺傳變異位點(diǎn)。2007年，《Science》雜志刊登了第一項與冠心病相關(guān)的GWAS結(jié)果之后，全世界已經(jīng)通過GWAS發(fā)現(xiàn)了多

5、個與冠心病發(fā)病相關(guān)的遺傳變異區(qū)域（如染色體9p21、1p13等）。2008年，Kathiresan等人在歐美人群中通過GWAS發(fā)現(xiàn)多個影響血脂水平的多態(tài)性位點(diǎn)與冠心病的發(fā)病有關(guān)。但是，大部分的GWAS都是以歐美白種人作為研究對象進(jìn)行，很少有在亞洲黃種人乃至中國漢族人群中進(jìn)行的GWAS。在本研究之前，日本學(xué)者曾報道他們在日本人群中進(jìn)行的血脂水平的GWAS。然而，該研究僅對甘油三酯和高密度脂蛋白水平進(jìn)行了研究，但對病因?qū)W和臨床診斷中更有意義

6、的總膽固醇和低密度脂蛋白水平的遺傳變異沒有進(jìn)行研究，更沒有研究影響血脂水平的遺傳變異與冠心病發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系。由于中國人與歐美人群的遺傳差異和與日本人在環(huán)境和生活方式等的不同，在不同人種中發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證GWAS的結(jié)果，能夠?yàn)樘剿髌渲虏『鸵赘行蕴峁└尚诺牧餍胁W(xué)證據(jù)。因此，本研究擬從影響冠心病發(fā)病的傳統(tǒng)危險因素血脂水平出發(fā)，以大樣本人群為基礎(chǔ)，在中國漢族人群中開展血脂水平的GWAS，并且在多個大樣本的獨(dú)立人群和冠心病的病例對照人群中驗(yàn)證上述陽

7、性結(jié)果，試圖通過篩選與血脂水平異常和冠心病發(fā)病相關(guān)的遺傳變異來研究基因型-表型-疾病三者的關(guān)系，為揭示冠心病的發(fā)病機(jī)制并為制訂防治策略提供依據(jù)。本研究共分為四個部分：
　　 第一部分：中國漢族人群血脂水平的全基因組關(guān)聯(lián)研究。血脂水平異常是影響冠心病發(fā)病的一個重要因素。血漿中的血脂包括了總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白等。人體內(nèi)血脂水平受到多種因素的影響，包括年齡、性別、體重、飲食和體力活動等。家系研究也證實(shí)了遺傳因

8、素對血脂水平有很強(qiáng)的作用。本研究于2008年開始，建立起了2.7萬人的同濟(jì)-東風(fēng)隊列，收集了包括問卷調(diào)查、體檢信息等資料和血液樣本。我們在同濟(jì)-東風(fēng)隊列的參與者中開展了血脂水平相關(guān)的GWAS。本研究分為發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證兩階段，在發(fā)現(xiàn)階段，我們在隊列中挑選了1461名健康中國漢族人，使用Affymetrix GeneChip Human Mapping 6.0芯片進(jìn)行全基因組掃描，每個樣本檢測了666,141個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（single

9、nucleotide polymorphisms，SNPs）。以P<10-5為選擇標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)與血脂水平（總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白）有顯著性關(guān)聯(lián)的染色體區(qū)域和遺傳變異位點(diǎn)。在另外兩個獨(dú)立的中國漢族人群樣本中分兩階段驗(yàn)證上述全基因組掃描中有顯著性意義的陽性SNPs。第一驗(yàn)證階段，在3840人中對28個SNPs進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果顯示，有12個SNPs位點(diǎn)，6個基因與血脂水平有顯著性關(guān)聯(lián)（P＜0.05）。然后，我們將通過第

10、一個驗(yàn)證階段的12個陽性SNPs位點(diǎn)繼續(xù)在另外一個有5374人的樣本中進(jìn)行第二階段的驗(yàn)證，以上12個位點(diǎn)全部驗(yàn)證出了陽性結(jié)果。他們分別是：與總膽固醇水平有顯著性相關(guān)的SNPs位點(diǎn)5個，全部位于1號染色體的DOCK7基因上（rs11207995、rs1168114、rs7518497、rs10889332和 rs4350231）；與甘油三酯水平有顯著性相關(guān)的SNPs位點(diǎn)6個，分別位于11號染色體的APOA4-APOA5-ZNF259-BU

11、D13基因簇的4個基因上（APOA4上的rs7396835，APOA5上的rs651821，ZNF259上的rs6589566、rs964184和rs4417316，BUD13上的rs17119975）；與低密度脂蛋白水平有顯著性相關(guān)的SNPs位點(diǎn)1個，位于19號染色體的TOMM40基因上（rs1160985）。用GWAS發(fā)現(xiàn)的SNPs對總膽固醇和甘油三酯水平進(jìn)行基因型評分，發(fā)現(xiàn)了多個SNPs對血脂水平的累積作用以及基因型與血脂水平之間

12、的劑量-效應(yīng)關(guān)系。本部分我們在中國漢族人群中通過GWAS發(fā)現(xiàn)12個SNPs位點(diǎn)以及6個基因與血脂水平有顯著性關(guān)聯(lián)。新發(fā)現(xiàn)SNPs位點(diǎn)10個（DOCK7上的rs11207995、rs1168114、rs7518497、rs10889332和 rs4350231，APOA4上的rs7396835，ZNF259上的rs6589566和rs4417316，BUD13上的rs17119975，TOMM40上的rs1160985）。
　　

13、第二部分：影響血脂水平的遺傳變異與中國漢族人群冠心病易感性的關(guān)聯(lián)性研究。血漿中的血脂水平是影響冠心病發(fā)病的一個重要因素。以低密度脂蛋白和總膽固醇水平為代表的血脂水平增高，會增加患冠心病的風(fēng)險。已有研究證實(shí)，血脂水平和冠心病發(fā)病風(fēng)險都受到遺傳因素的影響。在第一部分我們通過GWAS已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了與血脂水平有關(guān)的遺傳變異，但是，這些遺傳變異是否通過改變血脂水平來增大了冠心病發(fā)病的風(fēng)險有待于進(jìn)一步證實(shí)。為了證實(shí)這個假說，本部分在中國漢族人群和歐美人

14、群血脂水平相關(guān)的GWAS的基礎(chǔ)上，尋找與冠心病發(fā)病風(fēng)險有關(guān)的遺傳變異位點(diǎn)。結(jié)合第一部分中國漢族人群血脂水平相關(guān)的GWAS的結(jié)果和歐美報導(dǎo)的血脂水平相關(guān)的GWAS的結(jié)果，在第一節(jié)中篩選了8個與血脂水平有顯著性關(guān)聯(lián)的SNPs，其中3個是在中國漢族人的GWAS中發(fā)現(xiàn)的SNPs，有5個是在在歐美白種人中發(fā)現(xiàn)并報道的與血脂水平相關(guān)的SNPs。我們分兩階段在冠心病的病例對照中進(jìn)行研究：第一階段，我們在1376對冠心病的病例對照中發(fā)現(xiàn)與冠心病發(fā)病風(fēng)險

15、有顯著性關(guān)聯(lián)的SNPs（P<0.05）；第二階段，將第一階段篩選出來的陽性SNPs在另外1269例冠心病患者和2745例對照中進(jìn)行驗(yàn)證。本部分第一節(jié)結(jié)果顯示：位于染色體區(qū)域1p13的rs599839不僅與低密度脂蛋白水平有關(guān)（P=0.022），也與中國漢族人冠心病發(fā)病風(fēng)險有顯著性關(guān)聯(lián)（OR=0.76，P=0.001）；位于染色體區(qū)域16q的rs16996148不僅與低密度脂蛋白和高密度脂蛋白有關(guān)（P=2.9×10-4和 0.001），也

16、與中國漢族人冠心病發(fā)病風(fēng)險有顯著性關(guān)聯(lián)（OR=0.66，P=3.3×10-8）。這兩個SNPs都是通過GWAS新發(fā)現(xiàn)的與血脂水平相關(guān)的遺傳變異，雖然生物學(xué)功能有待于進(jìn)一步研究，但是它們有可能成為治療血脂異?；蛘吖谛牟〉男碌纳飳W(xué)靶點(diǎn)。另外，GWAS發(fā)現(xiàn)位于染色體6q26-27的基因簇SLC22A3-LPAL2-LPA上的遺傳變異與歐美人種冠心病的發(fā)病有顯著性關(guān)聯(lián)。該區(qū)域上有編碼血漿脂蛋白a [Lp(a)]的基因LPA。我們在2308名冠

17、心病病人和2332名對照人群中，對該基因簇上的5個SNPs位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。校正了冠心病的傳統(tǒng)危險因素后，我們發(fā)現(xiàn)3個SNPs位點(diǎn)rs3088442、rs7767084和rs10755578與冠心病的發(fā)病風(fēng)險有顯著性關(guān)聯(lián)。其中rs10755578的G和rs3088442的A等位基因均能顯著降低冠心病發(fā)病風(fēng)險（分別為 OR=0.91，95％ CI 0.84-0.99，P=0.033和OR=0.92，95％ CI 0.85-0.99)，P=

18、0.045）。由以上三個陽性SNPs構(gòu)建的單體型ACG與GTC相比較，能顯著性降低冠心病發(fā)病的風(fēng)險（OR=0.84，P=0.01）。本部分的研究結(jié)果提示，在中國漢族人群中發(fā)現(xiàn)五個與血脂水平有關(guān)的SNPs（rs599839、rs16996148、rs3088442、rs7767084和rs10755578）與冠心病發(fā)病風(fēng)險有顯著性關(guān)系。其中rs599839和rs16996148是通過GWAS新發(fā)現(xiàn)的SNPs，rs3088442、rs776

19、7084和rs10755578位于SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇上。提示這些遺傳變異可能通過改變血脂水平來影響冠心病發(fā)病的風(fēng)險，這將為進(jìn)一步闡明冠心病的發(fā)病機(jī)制和發(fā)現(xiàn)其干預(yù)靶點(diǎn)提供科學(xué)依據(jù)。
　　 第三部分：染色體9p21區(qū)域遺傳變異與中國漢族人群冠心病易感性的關(guān)聯(lián)性研究。冠心病的發(fā)生是多因素參與的復(fù)雜過程，是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果。2007年，《Science》雜志刊登了第一項與冠心病相關(guān)的GWAS之后，全

20、世界已經(jīng)通過GWAS發(fā)現(xiàn)了多個與冠心病發(fā)病相關(guān)的遺傳變異（如染色體9p21、1p13等）。通過前兩部分的研究，我們發(fā)現(xiàn)了通過影響血脂水平來改變冠心病發(fā)病風(fēng)險的遺傳變異。然而，冠心病的GWAS還發(fā)現(xiàn)了一部分獨(dú)立于任何傳統(tǒng)危險因素存在的遺傳變異，它們與我們已知的危險因素沒有直接關(guān)聯(lián)。本部分根據(jù)歐美冠心病GWAS的研究結(jié)果選擇了一個新發(fā)現(xiàn)的與冠心病發(fā)病風(fēng)險有很強(qiáng)關(guān)聯(lián)的遺傳區(qū)域。我們在中國漢族人群中驗(yàn)證這個獨(dú)立的遺傳區(qū)域，并且通過環(huán)境-基因交互

21、作用分析發(fā)現(xiàn)其可能的致病機(jī)制。本部分在歐美白種人的冠心病GWAS的報道中挑選了一個新發(fā)現(xiàn)的與冠心病發(fā)病相關(guān)的遺傳區(qū)域——染色體9p21區(qū)域。我們選擇了該區(qū)域上的2個SNPs位點(diǎn)rs2383206和rs2383207在中國漢族人群1360對的冠心病病例對照樣本中進(jìn)行基因分型。結(jié)果顯示：rs2383207的GG基因型頻率在冠心病的病例對照樣本中有顯著性差異，調(diào)整其它危險因素后，與基因型為AA者相比，基因型為GG者患冠心病的危險性增加（OR=

22、1.52，95％CI=1.13-2.04，P=0.015）。分層分析結(jié)果顯示，在以下的研究對象中攜帶rs2383206和rs2383207的GG基因型的人患冠心病的風(fēng)險增加：男性（分別是OR=1.57，95％CI 1.14-2.16和OR=1.96，95％CI 1.32-2.90），或者年齡小于60歲的人（分別是OR=1.35，95％CI 1.00-1.84和OR=1.58，95％CI 1.02-2.47），或者體重超重者（分別是OR=

23、1.52，95％CI 1.00-2.33和OR=2.39，95％CI 1.41-4.05），或者吸煙者中（分別是OR=1.55，95％CI 1.10-2.20和 OR=2.03，95％CI 1.34-3.08）。基因與環(huán)境交互作用分析發(fā)現(xiàn)rs2383207與吸煙具有交互作用（P=0.037）。攜帶rs2383206和rs2383207危險等位基因G和冠心病家族史具有很強(qiáng)的累積效應(yīng)（趨勢檢驗(yàn)P=7.0×10-6），同時攜帶4個等位基因G和

24、家族史這五種危險因素的人患冠心病的風(fēng)險增大了4.11倍（95％CI=1.80-9.35）。研究結(jié)果不僅證實(shí)了染色體9p21上的遺傳變異位點(diǎn)與中國漢族人關(guān)心發(fā)病風(fēng)險有顯著性關(guān)系，還有一些新的發(fā)現(xiàn)：我們首次發(fā)現(xiàn)在男性、年齡小于60歲的人、吸煙者和體重超重者中，攜帶rs2383206或者rs2383207 GG基因型的人患冠心病的風(fēng)險都增大；并且還發(fā)現(xiàn)rs2383207的基因型與冠心病的傳統(tǒng)危險因素（性別和吸煙）有交互作用。本部分結(jié)果表明：染

25、色體9p21上的遺傳變異位點(diǎn)rs2383206和rs2383207與中國漢族人的冠心病發(fā)病有關(guān)，G等位基因攜帶者患冠心病的危險性增加。危險等位基因G和冠心病家族史具有很強(qiáng)的累積效應(yīng)。
　　 第四部分：SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇陽性位點(diǎn)的功能研究。3’UTR一般位于基因下游3’端，它能維持mRNA的穩(wěn)定，一般還含有microRNA的結(jié)合位點(diǎn)，可能影響轉(zhuǎn)錄子的翻譯，最終影響到基因的表達(dá)水平。第二部分研究發(fā)現(xiàn)位于SLC2

26、2A3-LPAL2-LPA基因簇下游3’UTR區(qū)域的SNPs位點(diǎn)rs3088442與中國漢族人群冠心病的易感性有顯著性關(guān)聯(lián)。通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，位于3’UTR區(qū)域的rs3088442位點(diǎn)是多個microRNA的結(jié)合位點(diǎn)，可能會影響到mRNA的穩(wěn)定性。因此，本部分對rs3088442位點(diǎn)進(jìn)行了功能研究。采用報告基因?qū)嶒?yàn)檢測了rs3088442位點(diǎn)不同等位基因?qū)蟾婊驘晒馑孛富钚缘挠绊?。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在HepG2細(xì)胞株中，SLC22

27、A3-LPAL2-LPA基因簇下游3’UTR區(qū)域含rs3088442-G等位基因的質(zhì)粒熒光素酶活性明顯高于含rs3088442-A等位基因的質(zhì)粒（P<0.05）。本部分的結(jié)果提示SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇下游3’UTR區(qū)域的rs3088442-G等位基因可以增強(qiáng)熒光素酶的表達(dá)和活性。該位點(diǎn)可能是通過影響microRNA的結(jié)合來影響了SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇mRNA的穩(wěn)定性，從而對該基因簇基因表達(dá)起調(diào)控作用。

28、綜上所述，本研究從中國漢族人群的GWAS出發(fā)，探討了遺傳變異對血脂水平的影響，進(jìn)一步以冠心病的病例對照人群為研究對象，探討這些遺傳變異對冠心病發(fā)病風(fēng)險的影響，同時還在中國漢族人群中證實(shí)了位于染色體9p21區(qū)域的遺傳變異與冠心病易感性的關(guān)聯(lián)，并且對SNP的功能進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明：⑴在中國漢族人中進(jìn)行的GWAS發(fā)現(xiàn)，6個基因上的12個SNPs位點(diǎn)與血脂水平有顯著性關(guān)聯(lián)，其中新發(fā)現(xiàn)SNPs位點(diǎn)10個。⑵GWAS新發(fā)現(xiàn)的影響血脂水平的SN

29、Ps rs599839和rs16996148與中國漢族人的冠心病發(fā)病風(fēng)險也有顯著性關(guān)聯(lián)，可能是通過升高血脂水平來提高了冠心病發(fā)病的風(fēng)險。⑶位于SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇上的SNPs rs3088442、rs7767084和rs10755578與冠心病的發(fā)病風(fēng)險有顯著性關(guān)聯(lián)。位于該基因簇下游3’UTR區(qū)域的rs3088442-G等位基因可能提高了該基因簇基因表達(dá)水平，從而使血漿Lp(a)水平提高來增加了冠心病發(fā)病的風(fēng)險。⑷染

30、色體9p21的SNPs rs2383206和rs2383207與冠心病的發(fā)病風(fēng)險有顯著性關(guān)聯(lián)，這兩個SNPs的危險等位基因G與冠心病家族史有很強(qiáng)的累積效應(yīng)，基因-環(huán)境交互作用分析發(fā)現(xiàn)rs2383207與吸煙具有交互作用。
　　 本研究的創(chuàng)新之處在于：①在中國漢族人群中進(jìn)行血脂水平相關(guān)的GWAS，不僅驗(yàn)證了歐美白種人GWAS的結(jié)果，同時也在中國漢族人中發(fā)現(xiàn)了一些新的與血脂水平相關(guān)的遺傳變異和基因區(qū)域。②將新發(fā)現(xiàn)的與血脂水平相關(guān)的遺

31、傳變異位點(diǎn)在冠心病的病例對照人群中進(jìn)行進(jìn)一步研究，從基因型-表型-疾病三個方面出發(fā)，分析了遺傳變異-血脂水平改變-冠心病易感性之間的關(guān)系，不僅從生物學(xué)機(jī)制和致病機(jī)制上解釋了SNPs的功能，還可能為冠心病的防治提供新的治療靶點(diǎn)。③在中國漢族人中證實(shí)了染色體9p21區(qū)域上的遺傳變異對冠心病發(fā)病風(fēng)險的影響，并且發(fā)現(xiàn)了該區(qū)域基因-環(huán)境的交互作用以及多個危險因素間的累積效應(yīng)。④在多中心的獨(dú)立樣本中驗(yàn)證了GWAS和病例對照研究的結(jié)果，有嚴(yán)格的流行病