肌細胞增強因子-2與中國北方漢族人群冠心病的相關性研究.pdf

1、研究背景及研究目的: 心血管疾病是當今世界威脅人類健康最嚴重的疾病之一，其發(fā)病率和死亡率均超過腫瘤性疾病而躍居第一。其主要的表現(xiàn)形式包括冠心病(CHD)、心肌梗死(MI)、充血性心力衰竭、先天性心臟病等。目前認為，心血管疾病的發(fā)生與各種環(huán)境因素(諸如性別、年齡、血壓、血脂和糖尿病)和遺傳因素密切相關。雖然對于心血管疾病發(fā)生的病理學機制還不十分清楚，但是流行病學調查和雙胞胎遺傳背景的研究都已經充分肯定了遺傳學因素在心血管疾病中的關

2、鍵作用。通過對MONICA 監(jiān)測區(qū)域冠心病發(fā)生的流行病學調查結果分析，我國北方地區(qū)冠心病發(fā)病率和死亡率位居全國首位。因此，對中國北方漢族人群冠心病易感基因的研究對這一疾病的防治策略將具有重要意義。 早期的研究工作主要集中在冠心病高危風險因素相關基因的研究上，如血脂代謝、凝血和纖溶系統(tǒng)、血小板膜受體基因等。但迄今為止，這方面研究中仍未發(fā)現(xiàn)與冠心病發(fā)生直接相關的致病基因。近年來，人類基因組圖譜的繪制完成和單核苷酸多態(tài)性(SNP)第

3、三代遺傳學標記的出現(xiàn)，使得通過全基因組水平進行遺傳連鎖分析，定位多基因遺傳性疾病易感基因的研究工作成為可能。近年來，在冠心病易感基因研究領域中也取得了一些令人矚目的突破性進展。2000 年以后，在芬蘭人、印度人、墨西哥裔美國人中，幾個大規(guī)模冠心病遺傳易感基因的全基因組掃描工作被先后完成。綜合分析這些研究結果發(fā)現(xiàn)，某些易感位點上的定位結果具有一致性，主要集中在第1、3、6、9、14 號等染色體片段，但具體的易感基因位點尚未最終確定。200

4、3 年，王擎博士在美國白人冠心病遺傳家系中發(fā)現(xiàn)冠心病的致病基因是肌細胞增強因子-2 基因(Myocyte Enhancer Factor-2, MEF2A)，其在冠心病患者中的突變方式是第11 外顯子的21 個堿基的缺失突變。細胞功能實驗研究顯示，這種缺失突變通過負顯性效應機制影響轉錄因子MEF2A 基因在細胞核中的定位，同時降低MEF2A 的轉錄水平及蛋白質合成。隨后此研究組在冠心病的散發(fā)人群MEF2A 基因第7 外顯子上又發(fā)現(xiàn)了3

5、種致病的點突變(N263S，P279L，G283D)，以上研究進一步證實了MEF2A 基因是冠心病的致病基因。 人們最初發(fā)現(xiàn)MEF2A 是一種富含AT 序列的特異性肌細胞轉錄因子，調控多種骨骼肌和心肌細胞特異性基因的表達和轉錄。MFE2 超家族包含4種同源蛋白，MEF2A、MEF2B、MEF2C、MEF2D。MEF2A 基因定位于染色體15q26，由499 個氨基酸組成，屬于MADS 框轉錄家族，N 端的保守序列具有MADS

6、結構域和MEF2A 結構域，能夠與其他轉錄因子結合形成二聚體并具有DNA 結合活性；C 末端的磷酸化位點是多種激酶的靶點，與啟動基因表達有關，是MEF2A 因子活性調節(jié)及發(fā)揮功能的主要區(qū)域。MEF2A 基因位于多種肌細胞和內皮細胞特異性基因信號轉導通路的下游，能夠激活多種結構蛋白。MEF2A 基因敲除小鼠出生后表現(xiàn)出右心室擴張，肌細胞線粒體排列紊亂，并有發(fā)生猝死的可能。而MEF2C 缺陷小鼠則難以形成正常的心臟及脈管系統(tǒng)。因此，MEF2

7、 在調節(jié)血管平滑肌細胞增殖、內皮細胞發(fā)育和維持血管結構完整性中發(fā)揮著重要作用。由于MEF2A 與心血管系統(tǒng)疾病的關系仍然是目前爭論的焦點，為了明確MEF2A 基因與中國北方漢族人群冠心病發(fā)生的相關關系，我們進行了此項病例對照研究。 研究對象和研究方法: 1. 研究對象:從2003 年11 月至2006 年5 月，共入選726 例在沈陽軍區(qū)總醫(yī)院心內科行冠狀動脈造影的病人作為研究對象。其中男性492 例，女性234 例，

8、平均年齡57.2±10.5 歲。所有研究對象均簽署知情同意書。本實驗由醫(yī)院道德倫理委員會批準實施。 2. PCR 擴增飽和酚-氯仿法提取基因組DNA，PCR 方法擴增目的片段。PCR 引物設計由Primer 5.0 軟件包完成。PCR 擴增目的片段覆蓋第7 和第11 外顯子中有爭議的突變位點。 3. 第7 外顯子突變位點篩選使用PCR-SSCP 方法，根據預實驗結果確定PCR 擴增的效率、特異性以及變性聚丙烯酰胺凝膠

9、電泳分離單鏈構象多態(tài)的靈敏度。對于實驗結果中出現(xiàn)的異常片段，需要重復兩次，然后純化回收測序，并最終證實突變的位置和具體形式。 4. 第11 外顯子(CAG)n 等位基因的基因型分析根據預實驗中電泳及測序結果，將具有(CAG)的11 次重復序列作為標準序列，其PCR 產物作為內參，與待檢測樣品的MEF2A 第11 外顯子PCR 產物在15 ％中性聚丙烯酰胺凝膠中，室溫下電泳5 h，300 伏電壓，銀染顯色。 將具有特殊

10、電泳圖形的PCR 產物純化回收，送測序鑒定。 5. 統(tǒng)計學分析應用四格表卡方檢驗方法計算病例組和對照組等位基因的分布頻率，用卡方檢驗方法計算Hardy-Weinberg 平衡分布。Logistic 回歸計算各種獨立危險因素對冠心病發(fā)病的預測價值，同時計算相對危險度和95 ％可信區(qū)間。 Jonckheere-Terpstra 趨勢檢驗方法判斷(CAG)n 等位基因與病變血管程度之間的相關關系。所有統(tǒng)計計算由SPSS13

11、.0 軟件包完成。 結果: 1. 入選研究對象基線特征在所入選的726 例中，冠心病組378 人，無冠心病348 人。比較兩組病人的臨床基線特征，冠心病組在各種常見危險因素(諸如吸煙、高血壓和糖尿病等)方面均明顯高于對照組。 2. 第7 外顯子基因突變的研究所有726 例入選研究對象MEF2A 基因第7 外顯子PCR 擴增片段，經PCR-SSCP 檢測后，未發(fā)現(xiàn)致病突變。 3. 第11 外顯子(CA

12、G)n 等位基因的基因型分析(CAG)n 各種等位基因的基因型在人群中的整體分布符合Hardy-Weinberg平衡定律；對冠心病組和對照組各種等位基因基因型的分析發(fā)現(xiàn)，(CAG)n=11等位基因在對照組的分布頻率明顯高于冠心病組(p=0.001)；而(CAG)n=9 等位基因在冠心病組的分布頻率明顯高于對照組，兩者相比存在顯著性差異(p＝0.000, OR=1.958, 95 ％CI=1.412-2.714)。這一結果表明，(CAG)

13、n=9 等位基因與冠心病的發(fā)生存在相關關系。為了進一步判斷(CAG)n=9 等位基因對冠心病的預測價值同時排除由于基線不匹配對實驗結果造成的影響，應用Logistic 回歸分析方法，將(CAG)n=9 等位基因與冠心病常見危險因素進行了綜合比較，發(fā)現(xiàn)(CAG)n=9 等位基因是冠心病發(fā)生的獨立危險因素(p=0.001, oddsratio=1.245, 95 ％CI=1.095-1.417)。根據冠狀動脈造影結果，分析(CAG)n 等位

14、基因與冠狀動脈嚴重程度之間的相關關系，發(fā)現(xiàn)(CAG)n=9 等位基因在對照組中的分布頻率最低(23.7 ％)，隨病變血管支數的增加，(CAG)n=9 等位基因在各組中的分布頻率呈遞增趨勢，在三支血管病變患者中所占比例最高(39.7 ％)，Jonckheere-Terpstra 趨勢檢驗結果顯示，(CAG)n=9 等位基因與冠狀動脈病變血管支數之間存在相關關系。 結論: MEF2A 基因第11 外顯子(CAG)n 短串重