基于苯并吡喃類化合物凝膠上糖蛋白預(yù)染檢測技術(shù)的建立.pdf

1、目的:
　　1.在苯并吡喃類化合物基礎(chǔ)上合成篩選出一系列含酰肼基團染料，針對性地對復(fù)雜蛋白樣品中的糖基化蛋白進行檢測。
　　2.為糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)研究人員提供相對于凝膠后染模式更為便捷、高效、可靠且靈敏的糖基化蛋白特異性預(yù)染檢測技術(shù)。
　　方法:
　　1.根據(jù)文獻理論指導(dǎo)及實驗室實驗經(jīng)驗得出苯并吡喃類化合物母核在凝膠分離過程中對蛋白質(zhì)基本無吸附性，此特點有利于其在糖基化蛋白染色中保持良好的選擇性，此外根據(jù)含酰肼基

2、團的染料可通過希夫堿反應(yīng)特異性地結(jié)合糖基化糖蛋白肽鏈部分。根據(jù)以上兩點合成篩選系列含酰肼基團染料的苯并吡喃類化合物作為備選染料。
　　2.在備選染料中挑選出溶解性好、熒光強、合成產(chǎn)率高、毒性低且合成成本低廉的染料進行下一步考察。
　　3.混合糖基化標(biāo)準(zhǔn)蛋白及非糖基化標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品且從小鼠肝、心肌、腎臟、腦、血液等組織中挑選出合適蛋白樣品對建立的預(yù)染檢測法進行考察，組織樣品必須包含一定量糖基化蛋白。
　　4.建立希夫堿反應(yīng)

3、氧化部分，要求溫和氧化反應(yīng)，氧化性過強的氧化劑可將醛基過度氧化為羧酸，導(dǎo)致檢測方法選擇性的失效。從不同無機氧化劑中挑選適合氧化劑，且對氧化劑濃度、氧化溫度、氧化時間等條件進行考察，確保充分氧化。
　　5.篩選適合的還原劑中和過量殘留的氧化劑，要求充分中和過量殘留氧化劑且不影響下步染料結(jié)合反應(yīng)。從不同還原劑中挑選適合還原劑，且對還原劑濃度、還原溫度、還原時間等條件進行考察，確保充中和殘留氧化劑。
　　6.基于挑選出的染料對已經(jīng)

4、包含醛基的糖基化蛋白進行結(jié)合染色，同樣需要對染料的濃度、溶液體系、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間等條件進行篩選。最終要求結(jié)合了染料的糖基化蛋白適應(yīng)下步凝膠電泳系統(tǒng)及熒光采集儀器。
　　7.對分離好蛋白的凝膠在熒光采集儀下選擇適應(yīng)波長對染料進行激發(fā)，從而采集糖基化蛋白熒光信號。
　　8.從去糖基化、糖蛋白富集、質(zhì)譜、同其他糖基化檢測試劑盒比較等方面對建立好的糖基化蛋白特異性預(yù)染檢測技術(shù)的選擇性進行進一步考察。
　　結(jié)果:
　　

5、1.從所獲得的苯并吡喃類染料中篩選出4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼染料作為預(yù)染檢測法篩選基礎(chǔ)，其在溶解性、熒光及成本方面均優(yōu)于其他備選染料。
　　2.從氯鉻酸吡啶、高碘酸、高碘酸鈉、雙氧水等中弱氧化劑中挑選出高碘酸作為希夫堿反應(yīng)氧化部分氧化劑，其能在在一定濃度條件下在15分鐘內(nèi)將糖基化蛋白不過度氧化。
　　3.從亞硫酸鈉、抗壞血酸(VC)、亞硫酸氫鈉等常見還原劑中篩選出抗壞血酸用于定量消除過量殘留高碘

6、酸，其優(yōu)勢在于在不影響下步染料結(jié)合反應(yīng)的前提下，可以肉眼觀察是否完全消除過量殘留高碘酸。
　　4.基于以上研究結(jié)果建立糖基化蛋白特異性預(yù)染檢測技術(shù)，操作步驟如下:
　　(1)在10μL含0.5-10μg蛋白樣品（不足10μL用重蒸水補足）中加入等量0.03 M高碘酸水溶液，置于避光處進行氧化反應(yīng)10 min;
　　(2)在反應(yīng)液中加入0.3 M抗壞血酸5μL，搖勻反應(yīng)1 min;
　　(3)在反應(yīng)液中加入濃度為1

7、.4％4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼DMF溶液2.5μL，不同溫度環(huán)境下反應(yīng)30min;
　　(4)在反應(yīng)液中加30μl體積3X上樣緩沖液，搖勻;
　　(5)電泳，觀察。
　　5.將新建立的糖基化蛋白特異性預(yù)染檢測技術(shù)同Pro-Q Emerald488糖蛋白檢測試劑盒從靈敏度及選擇性角度進行對比，均與Pro-Q Emerald488相當(dāng)。
　　6.人血清陽性信號區(qū)通過質(zhì)譜途徑檢測到25個糖